Бамбуковая мозаика: Мозаика из бамбука — бамбуковая мозаика

В область, кодирующую HLD BaMV, добавляли BamHI и SacI на 5′- и 3′-концах, соответственно, с помощью ПЦР и вставляли в открытый BamHI-SacI pETDuet для получения меченного His HLD BaMV. Вирусный белок был экспрессирован в виде телец включения в E. coli BL21 (DE3).Чтобы очистить вирусный белок, тельца включения растворяли и повторно укладывали согласно протоколу, описанному ранее (10). Более подробно, тельца включения растворяли в протеиновом буфере, который содержал 50 мМ Трис (pH 7,5), 20 мМ KCl, 0,1% Brij-35, 10% глицерин и 10 мМ β-меркаптоэтанол с добавлением 8 М мочевины. Раствор растворенного белка добавляли по капле к 40 объемам осторожно перемешиваемого белкового буфера для ренатурации белка. Супернатант белкового раствора смешивали со смолой Ni ²⁺ — нитрилотриуксусной кислоты (NTA).После обширной промывки протеиновым буфером с добавлением 1 M KCl и 20 мМ имидазола повторно свернутый BaMV HLD элюировали протеиновым буфером с добавлением 500 мМ имидазола. Аналогичным образом, ПЦР-амплифицированный фрагмент кДНК, кодирующий аминокислоты с 451 по 857 репликационного белка FoMV, был вставлен в pETDuet с использованием сайтов разрезания BamHI и EcoRI, и плазмидная конструкция была трансформирована в E. coli BL21 (DE3). Получение His-меченного FoMV HLD было таким же, как приготовление BaMV HLD, описанного выше.

Для получения слитого белка CP _BaMV -T18 культуру рекомбинантного E. coli BL21, несущего pUT18-CP _BaMV , обрабатывали 0,4 мМ IPTG в течение 16 часов при 37 ° C. Клетки разрушали обработкой ультразвуком, и белок в супернатанте собирали после 10-минутного центрифугирования при 15000 × g . Для получения слитого белка CP _FoMV -T18, ПЦР-амплифицированный ORF5 FoMV был вставлен в pUT18 с использованием сайтов разрезания HindIII и EcoRI, и плазмидная конструкция pUT18-CP _FoMV была трансформирована в E.coli BL21. Получение слитого белка было таким же, как описано для CP _BaMV -T18.

Для продукции BaMV CP в E. coli , BaMV ORF5 был добавлен с NdeI и EcoRI на 5′- и 3′-концах соответственно с помощью ПЦР и вставлен в NdeI-EcoRI-открытый pET29. Затем плазмидной конструкцией трансформировали E. coli BL21 (DE3). Для индукции экспрессии белка в культуру рекомбинантной E. coli добавляли 0,5 мМ IPTG и культивирование продолжали при 30 ° C в течение 10 часов.Собранные клетки разрушали обработкой ультразвуком в буфере для экстракции белка, который содержал 50 мМ Трис (pH 8,0), 200 мМ NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 1 мМ EDTA с добавлением 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Экстракт доводили до содержания 300 мМ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . После центрифугирования супернатант загружали в колонку с фенил-сефарозой (1,6 на 10 см; GE Healthcare), и белки, связанные с колонкой, элюировали с линейным градиентом (NH ₄ ) ₂ SO ₄ (От 150 до 0 мМ) в буфере для экстракции белка.Фракции, содержащие BaMV CP, концентрировали и диализовали против буфера для экстракции белка без NaCl. Затем белковый раствор загружали в колонку DEAE-Sepharose (1,6 на 10 см; GE Healthcare), и элюирование выполняли линейным градиентом NaCl (от 0 до 1 M) в буфере для экстракции белка. Наконец, фракции, содержащие BaMV CP, были сконцентрированы, и CP внутри был дополнительно очищен с помощью колонки Sephacryl S-300 (1,6 × 60 см; GE Healthcare).

Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA).

Указанные количества E. coli -экспрессируемого ХП BaMV были смешаны с 1 фмоль ³² Р-меченая РНК-зонд в 12 мкл буфера, который также содержал 20 мМ Трис (pH 8,0), 3 мМ MgCl ₂ , 10 мМ KCl, 2 мМ дитиотреитол (DTT) и 4% глицерин. После инкубации при комнатной температуре в течение 15 минут смесь разделяли на 6% -ном полиакриламидном геле и визуализировали с помощью авторадиографии. Зонд был приготовлен путем инкубации 5 мкг матричной ДНК, фрагмента 5′-нетранслируемой области (UTR) BaMV, которому предшествовал промотор Т7, с 0.5 мМ АТФ, 0,5 мМ CTP, 0,5 мМ GTP, 0,5 мкм UTP, 100 мкКи [α- ³² P] UTP (6000 Ки / ммоль), 1 мкл ингибитора РНКазы (40 Ед / мкл) и 3 мкл полимеразы Т7 (14 Ед / мкл) в 50 мкл транскрипционного буфера 1 × T7. После инкубации при 37 ° C в течение 2 часов матричная ДНК была удалена с помощью РНКазы E, и радиоактивно меченый зонд был очищен с помощью колонки MicroSpin G-50 (GE Healthcare).

Спектр кругового дихроизма.

E.coli -экспрессируемый BaMV CP очищали и доводили до концентрации 25 мкг / мл в 2 мМ фосфатном буфере (pH 7.2). Спектр в диапазоне от 190 до 250 нм регистрировали при комнатной температуре с помощью CD-спектрометра Jasco J-815, снабженного кварцевой кюветой с длиной пути 5 мм.

Опосредованная агробактериями экспрессия комплекса репликазы BaMV.

кДНК сателлитной РНК SF4 BaMV добавляли с последовательностями узнавания HindIII и ClaI на 5′- и 3′-концах соответственно с помощью ПЦР и вставляли в бинарную плазмиду pKn. Эта конструкция размещала кДНК SF4 ниже промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CMV).Точно так же ORF5 BaMV вставляли в pKn с использованием сайтов разрезания XhoI и KpnI для продукции вирусного CP в растениях. ORF1 BaMV, который был помечен последовательностью, кодирующей гемагглютинин (HA) на 3′-конце, был вставлен в бинарную плазмиду pEpyon с использованием сайтов разрезания SmaI и SacI. pEpyon содержит последовательность ω1 TMV, которой предшествует промотор CMV 35S, так что трансляция белка репликации BaMV может быть усилена. Agrobacterium tumefaciens LBA4404, несущий указанные бинарные плазмиды, инфильтрировали в 3-недельные N.benthamiana растений. Листья собирали через 5 дней после инокуляции и гомогенизировали в буфере, который содержал 50 мМ Трис (pH 8,0), 15 мМ MgCl ₂ , 120 мМ KCl, 0,1% β-меркаптоэтанол, 20% глицерин, 1 мкМ пепстаин и 0,1 мМ фенилметилсульфонил. фторид (PMSF). После центрифугирования при 30000 × g в течение 1 ч мембранную фракцию (P30) собирали и солюбилизировали в детергентном буфере, который содержал 50 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl и 1,5% NP-40 для анализа коиммунопреципитации и эндогенного Анализ активности RdRp.

Анализ эндогенной активности RdRp.

Солюбилизированная фракция P30, содержащая указанные белки BaMV и РНК, была добавлена ​​в реакционный буфер, содержащий 30 мМ Трис (pH 8,8), 10 мМ MgCl ₂ , 20 мМ DTT, 2 мМ АТФ, 2 мМ CTP, 2 мМ GTP. , 2 мкМ UTP и 100 мкКи [α- ³² P] UTP (6000 Ки / ммоль), и смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. Продукт реакции экстрагировали равным объемом фенол-хлороформа, и нуклеиновые кислоты осаждали этанолом.Радиоактивно меченые продукты РНК разделяли на 0,8% агарозном геле и визуализировали с помощью авторадиографии.

Анализ репликации вируса в протопластах.

Получение протопластов N. benthamiana и плазмидную трансфекцию выполняли, как описано ранее (5). Вкратце, 3 мкг pCBG, инфекционного клона BaMV, несущего ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), или его производного смешивали с 1 × 10 ⁵ протопластов в присутствии конечного 20% полиэтиленгликоля 4000.Протопласты были разрушены через 2 дня после трансфекции, и скопления вирусного CP и геномных РНК анализировали вестерн-блоттингом и нозерн-блоттингом соответственно.

Анализ инфекционности вируса в растениях.

Указанный инфекционный клон или его производное механически инокулировали в листья 3-недельного растения N. benthamiana или Chenopodium quinoa в дозе 2 мкг ДНК на лист, как описано ранее (21). Экспрессию GFP, представленную флуоресцентными пятнами, в инфицированных растениях в указанные дни после инокуляции визуализировали с помощью Kodak Image Station 2000MM.

Нозерн-блоттинг.

была выделена из 1 × 10 ⁵ трансфицированных протопластов с использованием набора TriSolution Reagent Plus (GeneMark). Каждый образец РНК (17 мкг) обрабатывали 3 М глиоксалем и разделяли на 0,8% агарозном геле. После переноса и фиксации на нейлоновой мембране образцы гибридизовали с радиоактивно меченным зондом, комплементарным 3′-UTR BaMV. Зонд был получен в результате реакции транскрипции in vitro , которая содержала 5 мкг расщепленного HindIII pBaMV-O / SB2.6, 0,5 мМ АТФ, 0,5 мМ CTP, 0,5 мМ GTP, 0,5 мкМ UTP, 100 мкКи [α- ³² P] UTP (6000 Ки / ммоль), 40 Ед ингибитора РНКазы и 3 мкл полимеразы SP6 (14 Ед. / мкл) в 50 мкл транскрипционного буфера 1 × SP6. После инкубации при 37 ° C в течение 30 мин матричная ДНК была удалена с помощью РНКазы E, и радиоактивно меченый зонд был очищен с помощью колонки MicroSpin G-50 (GE Healthcare).

Просвечивающая электронная микроскопия.

Полноразмерная кДНК BaMV была амплифицирована из pCBG с помощью ПЦР и вставлена ​​в pKn с использованием сайтов разрезания SbfI и SacI. A. tumefaciens LBA4404, несущий инфекционные клоны на основе pKn, был инфильтрирован в листья 3-недельного растения N. benthamiana . Листья собирали через 5 дней после инфильтрации, и вирусные частицы внутри очищали в соответствии с протоколом, описанным ранее (20). Очищенные вирусные частицы на медной сетке отрицательно окрашивали 3% уранилацетатом и наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом (JEM-100CX II).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Скрининг двугибридных дрожжей.

Вирусы рекрутируют или захватывают факторы хозяина, чтобы завершить цикл репликации и ускользнуть от защитных механизмов хозяина. Для продолжения поиска растительных белков, которые взаимодействуют с белком репликации BaMV, вирусный HLD использовали в качестве приманки для скрининга против библиотеки кДНК BaMV-инфицированных листьев N. benthamiana . Первоначально было идентифицировано 60 колоний дрожжей, проявляющих гистидиновый автотрофный фенотип и значительную активность β-галактозидазы. Секвенирование ДНК показало, что 48 из этих 60 колоний содержали ген CP BaMV в своей добычной плазмиде (A).Высокая частота обнаружения CP в плазмиде жертвы предполагает сильное взаимодействие между двумя вирусными белками и / или обилие мРНК CP в инфицированных вирусом листьях. Количественный анализ активности β-галактозидазы показал более сильное взаимодействие между BaMV HLD и CP, чем взаимодействие положительного контроля (B). Для проведения анализа in vitro , меченный His HLD был экспрессирован в E. coli , которые образовали тельца включения, повторно свернули и очистили с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC).Очищенный HLD смешивали с неочищенной смолой E.coli -экспрессируемой BaMV CP и Ni ²⁺ -NTA. BaMV CP может быть обнаружен с HLD во фракции элюирования (C), что дополнительно подтверждает взаимодействие HLD-CP.

Взаимодействие между BaMV HLD и CP. (A) S. cerevisiae L40, экспрессирующие различные комбинации белков приманки и жертвы, выращивали на планшетах YC-WU / Z300, а затем переносили на фильтровальную бумагу для анализа активности β-галактозидазы. Клетки, экспрессирующие LexA-Fos2 и AD-Jun, использовали в качестве положительного контроля.(B) Дрожжевые клетки, экспрессирующие указанные белки приманки и жертвы, разрушали и инкубировали с O -нитрофенил-β-галактозидом в течение 10 часов. Активность определяли на основании оптической плотности, измеренной при 420 нм. (C) Совместная очистка ЦП BaMV с повторно свернутым His-меченным HLD с помощью IMAC. Ренатурация и очистка BaMV HLD описаны в разделе «Материалы и методы». Дорожки 2 и 3 представляют собой неочищенные экстракты E. coli , которые экспрессировали BaMV HLD и CP соответственно. Дорожка 4 показывает повторно свернутый HLD, очищенный из дорожки 2 с помощью IMAC.Дорожка 5 показывает совместную очистку HLD и CP с помощью IMAC. Следует отметить, что один только CP BaMV не может быть очищен с помощью IMAC (дорожка 6).

Агроинфильтрация-иммунопреципитация.

BaMV с эндогенной активностью RdRp во фракции P30 получали путем временной экспрессии HA-меченного вирусного репликационного белка с сателлитной РНК SF4 в листьях N. benthamiana через инфильтрацию Agrobacterium . Инкубация фракции P30 с меченными изотопами нуклеозидтрифосфатами приводила к образованию меченого изотопом SF4 (, дорожка 1).Чтобы определить взаимодействие in vivo и между репликационным белком BaMV и CP, два вирусных белка были коэкспрессированы в N. benthamiana . Коиммунопреципитация с использованием антисыворотки против НА показала, что CP можно было обнаружить в преципитате, если образец содержал вирус репликации вируса (дорожки 1 и 2). Поскольку оба вирусных белка обладают РНК-связывающей активностью, было неясно, связаны ли эти два белка косвенно через молекулы РНК. Удаление эндогенной сателлитной РНК SF4 нуклеазой микрококка не прерывает взаимодействия белков (дорожка 2), что позволяет предположить, что BaMV HLD и CP находятся в прямом контакте.

Взаимодействие in vivo между репликационным белком BaMV и CP. Рекомбинантные штаммы A. tumefaciens , несущие указанные плазмиды, экспрессирующие белок и РНК, инфильтрировали в листьев N. benthamiana , как описано в разделе «Материалы и методы». Фракцию Р30, выделенную из листьев, солюбилизировали и обрабатывали нуклеазой микрококка или без нее перед коиммунопреципитацией с использованием антисыворотки против НА (А). Вестерн-блоттинг указывает на присутствие CP в иммунном преципитате (A) и белка репликации BaMV (B) и CP (C) во фракции P30.Анализ эндогенной активности RdRp (D) использовали для подтверждения того, что сателлитная РНК SF4 во фракции P30 была удалена после обработки нуклеазой микрококков.

Бактериальный двухгибридный скрининг.

Сначала мы исследовали, может ли ферментативная активность HLD модулироваться CP. Присутствие CP не влияло на активность РНК 5′-трифосфатазы / NTPase HLD (данные не показаны). Для картирования областей CP, которые контактировали с HLD, ORF5 BaMV подвергали случайному мутагенезу с помощью подверженной ошибкам ПЦР.Бактериальная двухгибридная система была использована для скрининга мутантных CP, которые имели более слабую аффинность связывания с HLD по следующим причинам: (i) нет необходимости в трансформации между дрожжами и E. coli и ( ii) частота трансформации E. coli намного выше, чем у дрожжей. В этой системе аденилатциклаза была разделена на две части, Т18 и Т25; один был соединен с приманкой, а другой — с добычей. Взаимодействие наживки и добычи должно вернуть ферментативную активность для продукции цАМФ, что, в свою очередь, активирует транскрипцию оперонов lac и mal .Полезность этой системы скрининга в данном исследовании была впервые подтверждена путем выращивания рекомбинантного штамма E. coli BTh201, который продуцировал T25-HLD _BaMV и CP _BaMV -T18, на селективной среде M63, дополненной X-Gal и мальтозой. как единственный источник углерода. Взаимодействие между двумя вирусными белками будет поддерживать рост синих колоний на планшете со средой для отбора. Начальная плотность клеток, минимально необходимая для образования видимых синих колоний клеток, экспрессирующих T25-HLD _{, BaMV} и CP _{, BaMV} -T18, была на три порядка меньше, чем у клеток, не экспрессирующих вирусного слияния или не экспрессирующих только один вирус. белки (А).Более того, клетки, экспрессирующие два вирусных слитых белка, росли намного лучше, чем клетки, экспрессирующие T25-Zip и Zip-T18, используемые в качестве положительного контроля, что позволяет предположить, что взаимодействие между BaMV HLD и CP было относительно сильным в E. coli . Мутантные CP с более слабым сродством к HLD подвергали скринингу из случайно мутированной библиотеки CP. Впоследствии были идентифицированы три клона: CP (17-3), CP (1-22) и CP (7-1) (B). Секвенирование ДНК показало, что CP (1-22) содержал четыре аминокислотные мутации, а именно I130M, D170N, A209G и N218K, в то время как CP (17-3) и CP (7-1) имели одну мутацию N210S.Чтобы подтвердить дифференциальное взаимодействие вариантов CP с HLD, экстракты клеток E. coli , содержащие различные слитые белки CP-T18, были смешаны с очищенным His-меченным HLD и смолой Ni ²⁺ -NTA, и связанные белки были впоследствии элюируется. Количество CP дикого типа, совместно очищенного с His-меченным HLD, действительно было намного больше, чем количество двух мутантных CP (C).

Мутанты ЦП BaMV, которые имели более слабое сродство к вирусному HLD. (A) Аликвота 2 мкл E.coli BTh201 с указанной оптической плотностью добавляли на чашку с селективным агаром M63 и инкубировали при 30 ° C в течение 5 дней. Комбинации белков приманки и жертвы, экспрессируемые в клетках, были такими, как указано. Культуру клеток, экспрессирующих T25-Zip и Zip-T18, использовали в качестве положительного контроля. (B) Культуры клеток, экспрессирующие T25-HLD и указанные варианты CP-T18, выращивали на чашке с селективным агаром M63, как описано выше. (C) Экстракты клеток E. coli , содержащие указанные варианты CP _BaMV -T18, смешивали с очищенным His-меченным HLD и смолой Ni ²⁺ -NTA.После промывания 20 мМ имидазолсодержащим буфером белки элюировали 500 мМ имидазолсодержащим буфером. CP _BaMV -T18 во фракциях загрузки, промывки и элюата, а также HLD в промывке и элюате анализировали вестерн-блоттингом с использованием специфической антисыворотки.

Биохимическая характеристика мутантных ЦП.

Хотя существует четыре мутированных остатка CP (1-22), считалось, что A209 играет более важную роль, чем другие, потому что он находится рядом с остатком N210, который был заменен на серин в CP (17-3) и CP (7-1).Это предположение побудило нас предположить, что область вокруг A209 и N210 CP вносит значительный вклад во взаимодействие белков. Соответственно, две одиночные мутации, A209G и N210S, и одна двойная мутация, A209G / N210S, были созданы в векторе экспрессии CP на основе pET29. Чтобы определить, повлияют ли мутации на структуру белка, мы проанализировали спектры кругового дихроизма различных очищенных CP (). Почти идентичные спектры показали, что глобальная структура CP не была изменена мутациями.Основная функция CP — инкапсидирование вирусного генома. Мутационные эффекты на связывание РНК анализировали с помощью EMSA с использованием зонда, соответствующего 5′-UTR BaMV (). Результаты показали, что РНК-связывающая активность CP не изменилась в ответ на мутации.

Спектры кругового дихроизма различных КП BaMV. Приготовление белка и измерение CD были такими, как описано в разделе «Материалы и методы».

Аффинности связывания РНК различных CP BaMV. Сдвиги подвижности РНК-зонда, вызванные вариантами CP в нативном полиакриламидном геле, анализировали, как описано в разделе «Материалы и методы».Количество CP, использованное в анализе, составляло 0,23 мкг (1 ×) или 0,46 мкг (2 ×) на реакцию. Бычий сывороточный альбумин (BSA; 0,46 мкг) использовали в качестве отрицательного контроля.

Влияние мутаций CP на накопление BaMV в растениях.

Каждая из мутаций CP, A209G, N210S, A209G / N210S и делеция CP (ΔCP), была субклонирована в генетический фон pCBG и трансфицирована в протопластов N. benthamiana . Накопление вирусного ЦП и геномных РНК измеряли через 2 дня после трансфекции.Точечные мутации (A и B) не повлияли на накопление ЦП и геномной РНК. Однако уровень вирусных РНК был значительно снижен, когда ЦП отсутствовал (B). Различные инфекционные клоны также использовали для инокуляции N. benthamiana и C. quinoa . В этом исследовании зеленая флуоресценция, испускаемая GFP, была удобным маркером для мониторинга репликации и движения BaMV в растениях. В N. benthamiana инокуляция с использованием клона дикого типа привела к экспрессии GFP как в инокулированных, так и в системных листьях через 20 дней после инфицирования (dpi) ().Напротив, инокуляция с использованием любого из мутантных клонов не дала заметного количества GFP даже в инокулированных листьях. У C. quinoa на листьях, инокулированных клоном дикого типа, наблюдались четкие зеленые флуоресцентные пятна 7 dpi (A). Листья, инфицированные мутантом N210S, по-видимому, давали несколько тусклых флуоресцентных пятен. Однако не было четких признаков флуоресцентных пятен на листьях, инокулированных мутантом A209G, A209G / N210S или ΔCP. Отсроченное наблюдение показало, что мутант N210S действительно вызвал легкую инфекцию, поскольку отчетливые поражения появились на листьях в то время, когда листья, инфицированные клоном дикого типа, уже засохли (B).Уровни экспрессии GFP в инокулированных листьях N. benthamiana и C. quinoa , 20 и 7 точек на дюйм, соответственно, измеряли с помощью вестерн-блоттинга. Обилие GFP можно было обнаружить в обоих образцах растений, инокулированных клоном дикого типа; однако экспрессия GFP была редкой в ​​листьях, инфицированных мутантом N210S (). GFP не был обнаружен в листьях, инокулированных мутантом A209G или ΔCP. Взятые вместе, данные ясно показали, что мутации в A209 и N210 CP не оказывали вредного воздействия на репликацию вируса в растительных клетках; однако они действительно сильно задерживали перемещение вируса от клетки к клетке.Слегка различающиеся эффекты, вызванные мутациями A209G и N210S, побудили нас определить, коррелирует ли вредное воздействие на перемещение вируса с силой взаимодействия HLD-CP. Относительную аффинность связывания CP (A209G) и CP (N210S) с HLD сравнивали путем выращивания соответствующих клеток E. coli BTh201 на планшетах для селекции M63 с исходной плотностью клеток при 2-кратном серийном разведении (). Результаты показали, что CP (N210S) имел немного более сильную аффинность связывания с HLD, чем CP (A209G).

Влияние мутаций CP на репликацию BaMV в протопластах. pCBG и указанные производные трансфицировали в протопластов N. benthamiana , как описано в разделе «Материалы и методы». (A) Накопление ЦП BaMV в протопластах анализировали вестерн-блоттингом с использованием антисыворотки к ЦП BaMV. Количество окрашенной кумасси синим рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (l-RubisCO) использовали в качестве контроля загрузки белка. (B) Геномные и субгеномные РНК BaMV, накопленные в протопластах, анализировали методом Нозерн-блоттинга с использованием зонда, комплементарного 3′-UTR BaMV.На каждую дорожку загружали приблизительно 17 мкг общей РНК.

Влияние мутаций CP на инфекционность BaMV у N. benthamiana . Растения инокулировали pCBG или ее производными, как описано в разделе «Материалы и методы». Были получены флуоресцентные изображения листьев N. benthamiana с разрешением 20 dpi. Листья с 1 по 3 были инокулированными листьями; другие были верхними листьями.

Влияние мутаций CP на инфекционность BaMV у C. quinoa . (A) Листья C. quinoa инокулировали pCBG или ее производными, как описано в разделе «Материалы и методы».Флуоресцентные изображения инокулированных листьев C. quinoa получали с разрешением 8 dpi. (B) Влияние мутаций CP на развитие симптомов болезни. Фотографии инокулированных листьев были сделаны с разрешением 14 dpi.

GFP в инокулированных листьях N. benthamiana (A) и C. quinoa (B). Инокулированные листья в и A гомогенизировали в буфере, который содержал 50 мМ Трис (pH 8,0), 2% SDS, 2 мМ DTT и 4% глицерина. Относительные количества GFP в образцах анализировали вестерн-блоттингом с использованием антисыворотки против GFP.На каждую дорожку загружали 1,5 мг общего белка.

Дифференциальное связывание различных CP BaMV с HLD. Аликвоту 2 мкл E.coli BTh201, экспрессирующую указанные белки-приманки и жертвы, выращивали на планшете с селективным агаром M63, как описано в разделе «Материалы и методы». Клетки, экспрессирующие Т25 и Т18, использовали в качестве отрицательного контроля.

Чтобы определить, компетентны ли мутантные CP в образовании вирусных частиц, мы решили выделить вирион BaMV из протопластов, трансфицированных различными клонами pCBG.Попытка не увенчалась успехом, так как выход продукции был очень низким. Чтобы преодолеть эту проблему, полноразмерный транскрипт BaMV был временно экспрессирован в N. benthamiana с помощью A. tumefaciens . Вирионы BaMV из агроинфильтрованных листьев выделяли и очищали. Многие изгибающиеся вирусные частицы можно было увидеть под просвечивающим электронным микроскопом в каждом препарате, независимо от того, был ли он приготовлен из листьев, инфицированных вирусом дикого типа или мутантного (А).Очищенные вирионы разрушали, и молекулы РНК внутри анализировали электрофорезом на агарозе (B). По-видимому, вирусная геномная РНК могла быть инкапсидирована как диким типом, так и мутантными CP.

Вирионы BaMV, образованные различными мутантами ЦП BaMV. (A) Вирионы получали и наблюдали под просвечивающим электронным микроскопом, как описано в разделе «Материалы и методы». Все масштабные линейки показывают 100 нм. (B) Вирионы BaMV нагревали в буфере, содержащем 6 мМ фосфата (pH 7.2), 0,2 мМ EDTA, 1% β-меркаптоэтанол, 1% бентонит и 1% SDS при 60 ° C в течение 5 мин с последующей экстракцией фенолом. Очищенные молекулы РНК анализировали электрофорезом в 0,8% агарозе.

Влияние мутаций CP на накопление FoMV в растениях.

Известно, что CP необходим для передвижения потексвирусов. Согласно приведенным выше данным, роль ЦП BaMV в движении вируса определяется его способностью связываться с HLD. Таким образом, было важно знать, широко ли это явление сохраняется среди потексвирусов.Чтобы ответить на этот вопрос, аминокислотные последовательности нескольких CP потексвируса были выровнены, и результаты показали, что остаток, соответствующий BaMV A209, был консервативным (). Соответственно, A230 из FoMV CP подвергали мутагенезу. HLD репликационного белка FoMV экспрессировали с помощью His-метки на его N-конце в E. coli . Подобно BaMV HLD, белок образовывал тельца включения; поэтому его денатурировали, повторно свернули и очистили по протоколу, который использовался для приготовления BaMV HLD.Активность NTPase повторно свернутого белка (данные не показаны) предполагала, что он имел правильную конформацию. FoMV CP также экспрессировался в E. coli в виде слитого белка (CP _FoMV -T18). Взаимодействие между FoMV HLD и CP _FoMV -T18 было подтверждено совместной очисткой двух белков с помощью IMAC (A). Значительное количество CP _FoMV -T18 может быть обнаружено в элюате с FoMV HLD. Однако, когда мутация A230G была введена в CP, выход слитых белков CP в элюате резко снизился.Этот результат предполагает, что A230 участвует во взаимодействии HLD-CP. Такая же мутация была создана в инфекционном клоне FoMV pCF, и производное использовали для инокуляции C. quinoa . Поражения наблюдались на листьях, инокулированных pCF дикого типа 8 dpi; напротив, на листьях, получавших клон, несущий мутацию A230G (B), видимых повреждений не было.

Выравнивание частичных аминокислотных последовательностей CP среди нескольких представителей рода Potexvirus .Номера доступа GenBank для FoMV, PVX, вируса общей мозаики маниока (CcMV) и вируса кольцевой пятнистости гортензии (HrV): {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: » ABW25052 «,» term_id «:» 158268262 «,» term_text «:» ABW25052 «}} ABW25052, {» type «:» entrez-protein «,» attrs «: {» text «:» CAA61265 «,» term_id «: «872290», «term_text»: «CAA61265»}} CAA61265, {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «NP_042699», «term_id»: «9628112», «term_text» : «NP_042699»}} NP_042699 и {«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «YP_224088», «term_id»: «62326909», «term_text»: «YP_224088»}} YP_224088 соответственно.Консенсусные мотивы и остатки заключены в рамку. Звездочкой обозначены остатки, которые были мутированы в этом исследовании.

A230G мутация CP FoMV, которая снижает взаимодействие CP-HLD и снижает вирусную инфекционность у C. quinoa . (A) Очищенный His-меченный FoMV HLD смешивали с экстрактом E. coli , который содержал указанные слитые белки CP _FoMV -T18 и смолу Ni ²⁺ -NTA. Белки, связанные со смолой, очищали IMAC. CP _FoMV -T18 во фракциях загрузки и элюата и HLD в элюате анализировали вестерн-блоттингом с использованием специфической антисыворотки.(B) Развитие поражений на листьях C. quinoa , которые были инокулированы диким типом или мутантом A230G FoMV. Фотографии инокулированных листьев были сделаны с разрешением 8 dpi.

ОБСУЖДЕНИЕ

CP рода Potexvirus — это многофункциональный белок, играющий роль в сборке вирионов (15), перемещении от клетки к клетке (7) и регуляции вирусной трансляции (2). Кроме того, сообщалось, что CP регулирует репликацию РНК в других вирусах растений. Например, репликация РНК вируса мозаики люцерны (AMV) сильно стимулировалась при низких концентрациях CP, но постепенно снижалась при более высоких концентрациях (9).В анализе протопластов мы обнаружили, что делеция CP в BaMV значительно снижает накопление геномной РНК. В настоящее время неизвестно, как ЦП влияет на накопление РНК. Возможно, он играет роль, аналогичную роли AMV CP в активации репликации РНК. С другой стороны, присутствие CP может защищать РНК от деградации РНКазы, что приводит к увеличению накопления РНК.

Понимание механизма, лежащего в основе требования CP для перемещения потексвирусов, является важным вопросом. В этом исследовании было установлено, что BaMV CP взаимодействует с вирусным HLD.Мутации A209G и N210S на CP снижали аффинность взаимодействия и ограничивали перемещение вируса от клетки к клетке; однако функция CP в связывании РНК и инкапсидации генома оставалась неизменной. Этот результат согласуется с предыдущим представлением о том, что С-концевая область CP PVX играет роль в перемещении вируса независимо от инкапсидации (6). Важность взаимодействия HLD-CP в движении BaMV предполагает, что белок репликации BaMV включен в инфекционный объект, который перемещается к плазмодесмам и через них.Весьма вероятно, что инфекционный объект представляет собой комплекс РНП, включающий TGBp1, CP, РНК и белок репликации. Участие белка репликации TMV в комплекс вирусных перемещений было предложено на основании значительной разницы между временем, необходимым для распространения TMV от первично инокулированных клеток во вторичные клетки (т. Е. От 18 до 20 часов после инокуляции) и временем, необходимым для распространения от вторичный по отношению к третичным клеткам (от 2 до 4 часов) (13). Такое расположение позволяет TMV немедленно реплицироваться, как только он откладывается в соседней клетке.С тем же аргументом привлечение белка репликации BaMV в комплекс RNP позволит вирусу быстро повторно инициировать репликацию во вновь пораженных клетках. Вмешательство во взаимодействие CP-HLD с FoMV также лишило вирус способности двигаться, подразумевая, что рекрутирование белка репликации в комплекс движения вируса может быть общей особенностью потексвирусов.

HLD белка репликации BaMV предпочтительно связывает структуру, подобную клеверному листу, в 3′-UTR РНК BaMV (4).Если включение белка репликации вируса в комплекс движения необходимо для эффективного распространения BaMV в растении, почему взаимодействия между HLD и вирусной РНК недостаточно для выполнения этой работы? Уровень экспрессии CP в подавляющем большинстве случаев больше, чем уровень экспрессии белка репликации в то время, когда вирус перемещается. Поэтому мы предполагаем, что обилие CP будет мешать взаимодействию между белком репликации и РНК. Чтобы преодолеть эту ситуацию, вирус вызывает перенос своего белка репликации в двигательном комплексе посредством связывания CP с HLD.Как только комплекс откладывается в соседних клетках, CP удаляется из вирусной РНК с помощью еще неизвестного механизма, и белок репликации может немедленно начать репликацию вирусной РНК.

Вирус мозаики бамбука — обзор

2.1 Элементы вирусной РНК

Геномы вирусной РНК как PVX, так и вируса мозаики бамбука (BaMV) включают особые последовательности и структуры в нетранслируемой области (NTR), которые функционируют как цис -активные элементы для репликации вирусной РНК.Как резюмировано в предыдущей обзорной статье Verchot-Lubicz, Ye, and Bamunusinghe (2007), три структуры стебель-петля РНК (5’SL1, 5’SL2 и 5’SL3), первый из пяти повторяющихся элементов последовательности ACCA, и последовательность GAAA в структурах 5’SL1 и 5’SL2 в 5’NTR геномной РНК (гРНК) PVX — все они необходимы для репликации вирусной РНК (Kim & Hemenway, 1996; Kwon & Kim, 2006; Miller, Kim, & Hemenway, 1999; Miller, Plante, Kim, Brown, & Hemenway, 1998; Park, Kwon, Choi, Hemenway, & Kim, 2008; рис.3.1B). 5’SL1, в частности, важен для трансляции PVX, репликации вирусной РНК и инициации сборки вириона PVX (Kim & Hemenway, 1997; Kwon & Kim, 2006). Взаимодействия между консервативной октануклеотидной последовательностью (5′-AACUAAAC-3 ‘) и комплементарной консервативной октануклеотидной последовательностью (5′-GUUAAGUU-3’), расположенной в субгеномных (sg) промоторных областях TGB и CP, необходимы для sgRNA и накопление плюс-цепи гРНК (Hu, Pillai-Nair, & Hemenway, 2007; Kim & Hemenway, 1997, 1999; рис.3.1A и B). Согласно недавнему сообщению (Park et al., 2008), область 5’NTR гРНК PVX содержит пять повторяющихся последовательностей ACCA. Делеция, добавление и сайт-направленная мутация 5’NTR, включая пять повторяющихся последовательностей ACCA, показали, что первый элемент ACCA (нуклеотиды 10–13) влияет на синтез плюс-цепи gRNA и sgRNA, но не минус-цепи РНК, четвертый элемент ACCA (нуклеотиды 29–32) слабо влияет на репликацию вируса, а мутации в пятом элементе ACCA (нуклеотиды 38–41) снижают репликацию вируса, нарушая структуру SL1 (Park et al., 2008).

3’NTR генома PVX содержит три структуры «стебель-петля» (3’SL1, 3’SL2 и 3’SL3) и поли (A) хвост (Pillai-Nair, Kim, & Hemenway, 2003; рис. 3.1C). Две перекрывающиеся последовательности (т.е. 5′-UAUAAA-3 ‘и 5′-AAUAAA-3′, названные NUE1 и NUE2 соответственно), присутствующие в 3’SL1, важны для синтеза плюс-цепи гРНК и полиаденилирования (Pillai-Nair и др., 2003). Богатая U последовательность (5’-UAUUUUCU-3 ‘) в 3’SL2 влияет на накопление минус-цепи РНК и требуется для связывания с белками-хозяевами (Pillai-Nair et al., 2003; Sriskanda, Pruss, Ge, & Vance, 1996). Гексануклеотид (5’-ACAUAA-3 ‘в 3’SL3) и внутренние октануклеотидные последовательности (5-GUUAAGUU-3’, расположенные в промоторных областях sg TGB и CP) важны для синтеза минус-цепи РНК (Hu и др., 2007).

Подобно PVX, BaMV содержит элементы РНК в 5 ‘и 3’NTR вирусной гРНК, которые необходимы для репликации вируса. Некоторые штаммы BaMV связаны со сателлитными РНК (сатРНК), которые представляют собой линейные молекулы РНК длиной 836 нуклеотидов.К настоящему времени две сатРНК BaMV (satBaMV) хорошо изучены. Одним из них является BSL6, который снижает накопление РНК BaMV и ослабляет симптомы, вызванные BaMV, у коинфицированных растений. Другой — неинфекционная сатРНК, BSF4 (Hsu, Lee, Liu, & Liu, 1998). Как BaMV, так и его сатРНК имеют повторяющуюся последовательность 5’-GAAA (A) -3 ‘в 5’NTR и консервативную апикальную вторичную структуру «шпилька-петля» (AHSL) в длинном SL (LSL) и малом SL (SSL; Chen, Desprez, & Olsthoorn, 2010; Chen, Lin, et al., 2010).Эти два элемента важны тем, что они обеспечивают определенный интервал для инициации синтеза РНК с положительной цепью из матриц с отрицательной цепью (Chen, Desprez, et al., 2010; Chen et al., 2012; Chen, Lin, et al. ., 2010; Lin et al., 2005; Lin & Hsu, 1994). AHSL включает апикальную петлю, за которой следуют две внутренние петли (IL-I и IL-II), расположенные в верхней части LSL в области 5’NTR. IL-I и IL-II являются критическими элементами для репликации satBaMV (Annamalai, Hsu, Liu, Tsai, & Lin, 2003; Chen, Hsu, & Lin, 2007; Hsu et al., 2006). Эти элементы также являются ключевыми детерминантами для вмешательства в репликацию BaMV с помощью satBaMV (Hsu et al., 2006; Figs. 3.1D и 3.2A).

Рисунок 3.2. цис--действующих элементов 5 ‘и 3’NTR областей satBaMV. (A) Элементы области 5’NTR в двух типах satBaMV (BSF4-5’NTR и BSL6-5’NTR). Открытые треугольники (Δ) указывают последовательности повторов GAAA (A) в областях 5’NTR. Консервативные AHSL, содержащие две внутренние петли (IL-I и IL-II) в областях 5’NRT BaMV и satBaMV, обозначены прямоугольниками.Три или четыре маленькие петли ствола (SSL) и одна длинная петля ствола (LSL) присутствуют в областях 5’NTR. (B) Элементы в области 3’NTR satBaMV. Открытый треугольник (Δ) указывает сигнал полиаденилирования (5’-AAUAAA-3 ‘). Последовательность 5’-ACCUAA-3 ‘, расположенная в SLC в 3’NTR, является гексануклеотидным элементом.

3’NTR гРНК BaMV содержит три вторичные структуры (SLA, SLB и SLC) в домене ABC, подобном клеверному листу, домену D (SLD) и домену третичного псевдоузла (SLE; Cheng & Tsai, 1999; Tsai et al., 1999). Домены SLB, SLC, SLD и SLE важны для репликации BaMV, тогда как элемент SLA играет роль в перемещении BaMV на большие расстояния (Chen, Meng, Hsu, & Tsai, 2003; Huang, Huang, Meng, Hsu , & Цай, 2001). Подобно вторичным структурам BaMV в 3’NTR, satBaMVs имеют сходные структурные домены, за исключением SLA и SLD, в 3’NTR. Однако эти структуры сатРНК не функционируют таким же образом, как сходные структуры в BaMV (Huang et al., 2009).

Первый отчет о полных геномных последовательностях индонезийских изолятов вируса мозаики бамбука и обнаружении событий геномной рекомбинации

Индукция защитного иммунитета у свиней рекомбинантным вирусом мозаики бамбука, экспрессирующим эпитопы вируса ящура | BMC Biotechnology

Бамбуковая мозаика | Новый декоративный материал, заменяющий камень — керамика — стекло

После многих лет исследований и разработок мы успешно разработали бамбуковую мозаику, которая представляет собой новую замену камню, керамике, стеклу и металлическим материалам, расширяя использование мозаики во многих областях. Мы занимаемся исследованиями и разработками, производством и маркетингом бамбуковых полов с 2001 года, и у нас есть богатый опыт борьбы с бамбуком без сахара, сухого бамбука и борьбы с вредителями, это делает бамбук технически более стабильным и уникальным, эти технологии широко распространены. Используется в бамбуковой мозаике в процессе исследований и разработок, а производственный процесс является адекватным для обеспечения качества продукта.

Бамбуковая мозаика производится из высококачественного бамбука насыщенного цвета и текстуры, обезжиренной сухой механической обработки, шлифовки, полировки, антикоррозийной обработки, коллажа и других процессов обработки. Бамбуковая мозаика изящна, глубокого и яркого цвета, фактуры, нежна и внимательна. Бамбуковая мозаика — это энергосбережение, новый декор, хорошая стабильность размеров, удобство конструкции и монтажа.

На протяжении многих лет область украшения высокого уровня была занята камнем, керамикой, стеклом, металлической мозаикой, их богатыми цветами, естественными текстурами, а также изменениями огранки, возникающими в результате ассоциации, дающими неограниченное наслаждение красотой, но недостатком является что у них общий дефект; «жесткий» и «полный» и не может дать людям ощущение мягкости и тепла, не может использоваться во многих местах, таких как гостиная, детская комната, клубы для пожилых людей, женские места.

Бамбуковая мозаика использует бамбук в качестве сырья, резки, снятия сахара, высокотемпературного автоклава, изготовленного из сетчатой ​​ткани, адгезивных процессов новой мозаики.

Особенности бамбуковой мозаики:

Бамбуковые материалы дарят людям ощущение мягкости и тепла, они действительно отличаются от камня, стекла и металла, которые заставляют людей чувствовать холод.

Самобытная текстура и цвет натурального бамбука.

Расширить использование бамбукового декоративного материала, лучше приспособленного к высокой влажности и особым сухим местам

Хорошая изоляция, энергосбережение

Арт.: BM001 — NC

Размер плитки: 300 x 300 x 8 мм

Размер чипа: 48 x 48 мм

Поверхность: горизонтальная

Цвет: карбонизированный

Номер позиции: BM002 — SN

Размер плитки: 300 x 300 x 8 мм

Размер чипа: 48 x 48 мм

Поверхность: вертикальная

Цвет: натуральный

Номер позиции: BM003 — SC

Размер плитки: 300 x 300 x 8 мм

Размер чипа: 48 x 48 мм

Поверхность: Пряди

Цвет: Карбонизированный

Арт.: BM004 — SZ

Размер плитки: 300 x 300 x 8 мм

Размер чипа: 48 x 48 мм

Поверхность: Пряди

Цвет: Tiger

Купить Химачал Черный Бамбук 6×18 | Кварцитовая мозаика

В Wallandtile плитка — это наша страсть. Обладая более чем 40-летним опытом и 18+ складами в 48 штатах, мы создали альянсы и партнерские отношения со многими поставщиками по всему миру. У нас есть доступ к последнему выбору поддонов, лучшему качеству натурального камня, керамогранита, мозаичной плитки, брусчатки, бортов бассейнов, камней для бухгалтерских книг и многому другому, импортируемому из более чем 30 стран. WALLANDTILE предлагает более 8000 наименований товаров, включая натуральный камень (гранит, мрамор, травертин, сланец, известняк, кварцит и песчаник), фарфор, керамику, стеклянную плитку, деревянную мозаику и металлическую мозаику. Наш девиз ясен: покупай, строй, люби. Поддерживайте низкие цены, низкую прибыль и доставку к вашему порогу в кратчайшие сроки.

Мы понимаем, что покупательские привычки потребителей в США меняются. Мы понимаем, внедряем и действуем в соответствии с новейшими продуктами, задающими тенденции.Покупатели из США не хотят сильно завышать розничные цены в модных выставочных залах. Мы это понимаем. Интернет-продажи набирают обороты, поэтому мы прислушались и начали действовать.

Наша продукция варьируется от кухонной плитки, напольных покрытий для ванных комнат, акцентного камня для стен, мозаичной плитки для фартуков, камня для каминов в интерьере до брусчатки, бортов бассейнов, булыжника, брусчатки и многого другого для наружных жилых помещений. Мы также помогаем вам визуализировать ваше пространство на нашем веб-сайте, прежде чем заказывать товары. Эта удивительная технология помогла нашим клиентам спроектировать пространство для переоборудования прямо здесь, на нашем веб-сайте.Если вы строите новый дом, мы можем помочь вам оценить ваши планы. Для крупных жилых или коммерческих рабочих мест, пожалуйста, позвоните, чтобы получить прямые низкие цены. Для прямых заказов на загрузку контейнеров наши самые низкие цены просто потрясающие. Спросите нас о проектах, которые мы завершили, включая аэропорты, больницы, отели и курорты, а также о более чем миллионе довольных домовладельцев. Наша торговая сеть обслуживает архитекторов, строителей, дизайнеров, производителей, дилеров по ландшафтному дизайну, розничных магазинов напольных покрытий, индустрии гостеприимства и домовладельцев.Наши хорошо обученные и знающие продавцы могут предоставить вам необходимые инструменты и информацию, необходимые для продажи натурального камня.

Мы по-прежнему стремимся предоставлять нашим клиентам продукцию самого высокого качества по более низким ценам. Мы обещаем предложить «самые низкие цены на напольную плитку и мозаику» с лучшей политикой возврата и без каких-либо договоренностей, Wallandtile.com будет соответствовать или превзойти ЛЮБУЮ цену конкурентов.

12 «x 12» Бамбуковые палочки Мраморная мозаика

Восточно-белый и бежевый травертин выложены вертикальными и горизонтальными рядами, чтобы создать эту простую, но классически шикарную бамбуковую мозаику.Камни разрезают на прямоугольные части разного размера и укладывают в обоих направлениях, чтобы создать визуально привлекательный узор на сетке. Эта бамбуковая мозаика придает стильный вид своему окружению, сочетая в себе яркий белый мрамор и бежевые кусочки травертина. Цветовая гармония внутри плитки достаточно универсальна, чтобы вписаться в самые разные дизайнерские настройки и создать вневременной декор. Эта плитка из смеси мрамора и травертина может стать отличным фартуком на кухне практически любого цвета. Эта бамбуковая керамическая плитка также является хорошим выбором для акцентной полосы, которая может проходить через ваш фартук в сочетании с другими материалами и цветами.Плитка Bamboo Sticks может укладываться практически на любую поверхность, включая, помимо прочего, внешние и внутренние стены, полы, камин и красивые стены.

* Естественные прожилки и вариации встречаются на всех каменных плитках, включая восточно-белый мрамор и травертин, и могут привести к различию внешнего вида между фотографиями и изделиями. Если вы хотите измерить различия между плитками перед заказом, пожалуйста, «Запросите фотографии текущей партии» выше, чтобы просмотреть материал перед отправкой.