Ванна изабель тритон отзывы: Мишель, Катрин, Бриз, Цезарь, Эмма, Диана

Аэромассаж — Материал: акрил — Одноместная — Форма: угловая

Данные Яндекс. Маркета

Данные Яндекс. Маркета

Оценка: 5 из 5

Екатерина Б.

Достоинства: Дно у нее рельефное, считаю, что это весомый аргумент, чтобы приобрести именно тритон, т.к. безопасность, прежде всего!

Недостатки: Нет

Комментарий: Пользуемся ванной тритон Изабель полгода. Считаю, что для тест-драйва прошло достаточно времени и можно написать адекватный отзыв. Сначала мы ванну особенно берегли и мыли, чуть ли не каждый день. А потом я увидела, что с ней все хорошо и так и теперь мою ее только на выходных. Особенно приходится очищать все металлические детали, т.к. на них быстро возникает налет из-за некачественной воды. В остальном все отлично, царапин нет, акрил лежит толстым слоем и нигде не отслаивается. Минусов в принципе и нет.

23 июля 2018, Симферополь

Оценка: 5 из 5

Мария С.

Достоинства: Идеальная ванна для того чтобы в ней полежать вечерком с книжкой.

Недостатки: Не нашла

Комментарий: Понравился дизайн ванны, т. к. я большая любительница водных процедур. У этой ванны есть подголовник, поэтому принимать ванну особенно удобно и приятно. Дно рельефное, я это оценила когда была в положении. Особенно боялась где-нибудь упасть. А рельефное дно мне это не давало сделать. В общем, я довольна своим приобретением и всем советую эту модель.

25 февраля 2019, Ижевск

Оценка: 5 из 5

Екатерина Долгих

Достоинства: Защитный экран на магнитах, легко моется, несмотря на рифленое дно

Недостатки: Не обнаружила

Комментарий: Мне подружка нарассказывала всяких ужасов про акрил и я долго не решалась на покупку. Но потом поговорила со знающими людьми и приобрела тритоновскую ванну. Ни одно плохое предсказание не сбылось. Акрил не поцарапался за год и не пожелтел. Даже рифленое дно такое же белое, как в день покупки. Я мою его специальным гелем, все прекрасно отмывается. Теперь санузел – моя любимая комната в доме!

19 июня 2018, Екатеринбург

Оценка: 5 из 5

Анна Р.

Достоинства: Угловая форма, есть выемки для гелей, антискользящее покрытие

Недостатки: Нет

Комментарий: Давно мечтала о хорошей угловой ванне. Бассейн дома мне был не нужен, просто хотелось купить что-то такое, в чём можно было бы вечером с бокалом вина и книжкой полежать. Эта ванна как раз для таких целей и предназначена. Форма у нее удобная, места достаточно, теперь я могу полностью расслабиться. Ухода она особого не требует, главное вовремя мыть. Пока не заметила желтизны или царапин, надеюсь, что их и не будет.

26 апреля 2018, Великий Новгород

Оценка: 5 из 5

Денис Гудков

Достоинства: Дизайн простой и без излишеств, но в то же время изысканный. Есть защитный экран, хорошо встал.

Недостатки: Нет

Комментарий: Был впечатлен внешним видом этой ванны. Выглядит она шикарно. Все подводы и внутренний каркас мы спрятали за защитным экраном, который входил в комплект. Он хорошо подогнан, никаких проблем с его установкой не было. Акрил ничем не пахнет, теплый и гладкий. Только дно немного рельефное. В такой большой ванне это правильно, т.к. можно легко поскользнуться. У нас такой проблемы точно нет.

24 сентября 2018, Москва

Оценка: 5 из 5

Татьяна С.

Достоинства: Отличное качество покрытия, нестандартная форма, привлекательный дизайн

Комментарий: Когда выбирала ванну, обращала внимание на срок службы. Тритон дает гарантию на покрытие на 10 лет! Немного производителей готовы дать такие гарантии. Плюс отечественной компании я доверяю больше, чем зарубежным. Однозначно не хотела брать чугунные и металлические ванны. Первые не делают красивой формы, а вторые просто ненадежные. В общем, остановилась на Изабель и очень довольна результатом! Ванна выглядит необычно. За 5 месяцев использования внешний вид никак не изменился.

12 октября 2018, Волгодонск

Оценка: 5 из 5

Светлана Шунк

Достоинства: Ножки регулируются по высоте, устанавливается без сложностей, акрил белый и теплый

Недостатки: Не увидела

Комментарий: Купили Изабель в 2017 году. Пока что не знаю даже какие недостатки можно выявить. Ванна по форме просто загляденье! Одна сторона длинная, другая короткая. В нашем санузле именно такая и нужна была. При покупке сразу посмотрела, чтобы ножки регулировались, т.к. дно у нас совсем неровное. Прошлая ванна стояла криво и поэтому в одном месте все время собиралась вода. Сейчас мы этого избежали, когда ванну ставили.

31 августа 2018, Москва

Оценка: 5 из 5

Светлана Б.

Достоинства: Красивая угловая форма, смеситель сбоку, антискользящее покрытие

Недостатки: нет

Комментарий: Не понимаю, почему считается, что это одноместная ванна, т. к. при желании в ней спокойно можно вдвоем разместиться. Форма красивая, согласитесь? Я такие больше нигде не видела. А какая она удобная! Ну, просто сказка. Даже предусмотрели, что смеситель у нее сбоку. В ней вообще все предусмотрено, даже каркас специальный. Сделан из металла, между прочим, очень прочный!

25 мая 2018, Москва

Оценка: 5 из 5

Анна п.

Достоинства: Угловая форма с изюминкой, симпатичный дизайн, стальной каркас,

Недостатки: Не было

Комментарий: Прежде чем выбрать эту ванну, я пересмотрела кучу вариантов. Эта мне сразу как-то запомнилась своей асимметрией. Даже не думала об угловой ванне, но когда все измерила, оказалось, что она прекрасно войдет в наш санузел. Установка никаких неудобств не составила. У нее стальной каркас, который выдерживает вес даже двоих человек, хотя предназначена она только для одного, но мы вдвоем входим. Нравится, что есть функция массажа, приятно полежать после рабочего дня.

21 февраля 2018, Домодедово

Оценка: 5 из 5

Елена К.

Достоинства: Стильная угловая форма, придала некую изюминку нашей отремонтированной ванной комнаты в сталинке.

Недостатки: —

Комментарий: Красивая ванна нестандартной угловой формы. Очень удобная в использовании. Качественный гидромассаж, особенно мне нравятся форсунки для массажа спины. Менеджер конечно описывал нам её от и до, когда пришли покупать, но в дома в действии всё еще лучше.

22 декабря 2017, Москва

Ванна акриловая TRITON 1700х1000 ИЗАБЕЛЬ ПРАВАЯ с каркасом БЕЗ ЭКРАНА — Бытовая сантехника

Ванна акриловая TRITON 1700х1000 ИЗАБЕЛЬ ПРАВАЯ с каркасом БЕЗ ЭКРАНА

Сеть магазинов «Сантехник&Электрик» представляет для вашего выбора большой ассортимент качественной сантехники и электрики. Мы сотрудничаем с ведущими производителями сантехнического и электрического оборудования. Товары, которые вы купите в нашей сети, будут доставлены к вашему дому в Твери и Тверской области.

Покупать сантехнику и электрику в нашем магазине удобно, и персонал торговой сети стремится сделать сотрудничество с покупателями более выгодным и удобным. Спасибо, что выбрали нас!

Не прилагая усилий купить Ванна акриловая TRITON 1700х1000 ИЗАБЕЛЬ ПРАВАЯ с каркасом БЕЗ ЭКРАНА в Твери и Тверской области вы сможете в нашем магазине «Сантехник&Электрик» двумя способами:

Заказ через форму на сайте.

• Заказы через сайт принимаются круглосуточно. После выбора товара, нажмите на   кнопку Купить , которая находится справа от основного фото товара.
• Выбранные товары помещаются в корзину, содержимое которой Вы можете просмотреть, нажав на пункт «Корзина покупок», в главном меню сайта.
• Для заказа находящихся в корзине товаров, нажмите на пункт меню «Оформить заказ» и пройдите все шаги оформления заказа.
• После поступления заказа, менеджер перезвонит Вам по указанному Вами номеру телефона

• Позвоните нам: 8(4822) 41-55-74
• Согласуйте с оператором наличие Ванна акриловая TRITON 1700х1000 ИЗАБЕЛЬ ПРАВАЯ с каркасом БЕЗ ЭКРАНА в данный момент на складе.
• Сделайте заказ, сообщив свои данные, адрес доставки и желаемое время доставки.

Нет отзывов об этом товаре.

Написать отзыв

La Seigneurie du Triton Rooms: изображения и обзоры

Рыбно-охотничий клуб «Тритон» имеет долгую историю. Как вы увидите, когда в первый раз пристыкуетесь и подниметесь по лестнице в сторону Клуба, его история более 120 лет повсюду, от главного зала до салона и игровой комнаты.Мебель, украшения, рыбацкая одежда, фотографии важных гостей в рамках рассказывают множество историй. Куда ни глянь, обнаруживается что-нибудь интересное. Любознательным людям непременно понравится существующая здесь глубокая и богатая история.

Но помимо наследия Тритона, существует очень реальная и современная уникальность места, которое помогает вам соединиться с природой и самим собой. Спокойное окружение озер, тропинок, дикой природы объединяет в себе идеальные элементы, которые позволили нам на мгновение избежать напряженной жизни, которую мы все ведем.И да, наши дети-подростки действительно наслаждались отдыхом вдали от Интернета, Facebook и SMS :-))

Мы выбрали рыболовный пакет и остались полностью довольны этим опытом. Команда Triton позаботится обо всех ваших потребностях в рыбалке, будь вы новичок или опытный рыбак. Стефан, наш гид в течение первых трех дней, позаботился о том, чтобы у нас было все необходимое, чтобы успешно поймать ручейную форель. Он был чрезвычайно вежлив, уважителен и позаботился о том, чтобы мы знали, что он всегда рядом, если нам понадобится помощь.Чтобы добраться до озера Л’Эсперанс, нужно пройти пешком, но по запросу предоставляется организованный транспорт, если у кого-то ограниченные возможности передвижения. Есть две лодочные переправы и примерно 20 минут ходьбы в гору, чтобы добраться до озера L’Esperance, но усилия того стоят.

Обед на берегу — поистине уникальный опыт. Ежедневно с полудня до 14:30 гости могут спуститься со своих мест для рыбалки или пройти по тропе от клуба до обеда на берегу. Я настоятельно рекомендую посетить это мероприятие.Повар готовит второе блюдо на гигантском гриле. В первый день у нас была восхитительная курица-гриль с кокосовым соусом, а на следующий день — куриные гамбургеры. Основное блюдо включает гарнир из овощей, салата и десерта. Обеденная зона накрывается на случай дождя. Вы также можете приготовить утренний улов на гриле.

После напряженного дня, проведенного на озере, всегда приятно вернуться в душ, а затем посетить вечерний ужин (требуется предварительный заказ, но персонал очень гибкий, если вы когда-нибудь решите остаться на озере подольше, чтобы поймать больше рыбы).Мы все согласились, что еда была отличной, в ней было хорошее разнообразие, и мы пришли со всей особой заботой, на которую мы рассчитывали. У нашего официанта Саймона было уникальное чувство юмора, и он действительно заставлял нас чувствовать себя комфортно. Нашим предметом сопротивления была татарская форель, которую мы приготовили для наших обедов. За небольшую дополнительную плату повар использует вашу только что пойманную форель и приготовит восхитительный тартар. Нет ничего лучше этого. Карта вин была впечатляющей для удаленного рыбацкого домика. Так что у вас будет несколько хороших вариантов, чтобы сочетать вино с основным блюдом.

Для тех, кто останавливается в главном здании, как правило, комнаты на двоих и есть общие душевые / ванные комнаты. Все удобства очень чистые, кровати очень удобные. Учитывая наследственную природу здания, стены несколько тонкие, что делает храпящего соседа интересной особенностью. Люди, как правило, уважительно относятся к другим, и вскоре после 23:00 здесь становится тихо, что отлично подходит для тех, кто хочет рано вставать.

Большое спасибо всем в Triton за то, что сделали нашу четырехдневную поездку незабываемой. Конечно, это будет не последняя наша поездка туда.

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Есть много причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или уточнить у системного администратора.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Сборка натриевых каналов с регулируемым напряжением и затвор в виде димеров

В этом исследовании были использованы следующие плазмиды: pcDNA3.1-GFP- SCN5A (N-концевой GFP) ⁴ , pcDNA3.1-HA- SCN5A (подарок от Д-р Питер Молер, Колумбус, Огайо, США), pGFP-Ires- SCN5A , pEYFP-N3- SCN5A (C-концевой-YFP) и pECFP-N3- SCN5A (C-концевой-CFP) ⁹ .Усеченные слитые с GFP каналы субклонировали в плазмиду pcDNA3. 1. Контрольные эксперименты выполнены с pcDNA3.1 – YFP. Плазмида слитого с YFP диопеина представляла собой pEYFP-C1-дифопеин ³⁴ . Мутанты Na _v 1.5 вводили сайт-направленным мутагенезом (QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) и проверяли секвенированием. Все праймеры, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице 2.

Культура клеток и трансфекция

Клетки HEK293, полученные с помощью ATCC, культивировали в DMEM с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина.Все трансфекции были выполнены с использованием Polyfect (Qiagen). Для электрофизиологических экспериментов клетки HEK293 трансфицируют интересующими конструкциями в чашках с 35-миллиметровыми лунками, используя 0,3 мкг плазмид на 35-миллиметровую чашку, чтобы избежать насыщения токов. Для имитации гетерозиготного состояния клетки котрансфицировали 0,15 мкг каждой исследуемой конструкции. Для биномиального анализа, хотя мы по-прежнему поддерживали общее количество кДНК 0,3 мкг для каждой трансфекции, отношение мутантной кДНК к кДНК дикого типа изменялось с увеличением количества мутантной кДНК от 0 до 100% при одновременном уменьшении количества кДНК дикого типа.

Для коиммунопреципитации α-субъединиц Na _v 1,5 клетки HEK293 подвергали котрансфекции с использованием 1 мкг pcDNA3.1-HA- SCN5A WT и 1 мкг pcDNA3.1-GFP- SCN5A WT или мутанты в чашке диаметром 35 мм. Для коиммунопреципитации с Na _v 1,1 и Na _v 1,2 использовали HEK293, стабильно экспрессирующий каналы (щедрый подарок д-ра Альфреда Л. Джорджа).

Растворы для электрофизиологических записей

Клетки HEK293 трипсинизировали через 36 часов после трансфекции.Клетки, экспрессирующие GFP, зажимали заплатой. Для регистрации тока целых клеток клетки HEK293 были омыты во внеклеточном растворе Тирода, содержащем (в мМ): 150 NaCl, 2 KCl, 1 MgCl ₂ , 1,5 CaCl ₂ , 1 NaH ₂ PO ₄ , 10 глюкоза, 10 HEPES, pH 7,4 (NaOH). Среда для пипетки-пипетки была (в мМ): 35 NaCl, 105 CsF, 2 MgCl ₂ , 10 EGTA, 10 HEPES, pH доведен до 7,4 с помощью CsOH. Внеклеточный раствор тирода для iCells (Cellular Dynamics Inc, Мэдисон, Висконсин) содержал (в мМ): NaCl 25, N-метил D-глюкамин 105, CsCl 5.4, MgCl ₂ 1,8, CaCl ₂ 2, глюкоза 10, HEPES 10, низодипин 1,10 ^-3 для блокирования тока кальция, pH доведен до 7,3. Среда для пипетки-пипетки была (в мМ): CsMES 130, TEA Cl 20, MgCl ₃ 1, EGTA 10, HEPES 10, Mg-ATP 4, pH доведен до 7,3. Для одноканальной записи с прикрепленными клетками пипетка содержала (мМ): 280 NaCl, 5,4 KCl, 1 MgC1 ₂ , 2, CaC1 ₂ , 10 глюкозы, 10 HEPES (pH 7,3). Чтобы установить потенциал покоя мембраны на 0 мВ, использовали раствор ванны с высоким содержанием калия: 150 мМ KCl, 10 мМ HEPES, pH 7.4.

Электрофизиологические записи

Электрофизиологические записи выполняли при комнатной температуре с использованием метода патч-кламп в конфигурации целых клеток или прикрепления клеток с использованием усилителя Axopatch 200A (Axon Instruments, Калифорния, США). Для экспериментов с целыми клетками использовали патч-пипетки (Corning Kovar Sealing, код 7052, WPI) с сопротивлением от 1,9 до 2,5 МОм. Для одноканальных записей, подключенных к ячейкам, Sylgard использовался для уменьшения емкостных переходных процессов.Пипетки имели сопротивление 10–15 МОм. Использовалась фильтрация на частоте 5 кГц (-3 дБ, 8-полюсный фильтр нижних частот Бесселя), а токи оцифровывались на частоте 30 кГц (NI PCI-6251, National Instruments, Остин, Техас, США). Сбор данных производился с помощью pClamp 10, а для анализа использовали Clampfit (Axon Instruments).

Взаимосвязи между током и напряжением (кривые I / V) были измерены с шагом напряжения от -100 до +60 мВ с шагом 5 или 10 мВ в течение 50 мс с удерживающим потенциалом -120 мВ. Установившаяся инактивация -V _m была получена путем выдерживания ячеек при -120 мВ и затем подачи предимпульса длительностью 2 с от -140 до -30 мВ с шагом 5 мВ с последующим испытательным импульсом -20 мВ 50. РС.Одноканальные записи были получены по протоколу 100 разверток при 0,2 Гц, деполяризации при -40 мВ или -20 мВ от удерживающего потенциала -100 мВ.

Кривые активации и SSI были подогнаны к уравнению Больцмана:

$$ Y = 1 {\ mathrm {/}} \ left \ {{1 + {\ mathrm {exp}} \ left [{- \ left ({ {{V}} _ {\ mathrm {m}} — {{V}} _ {1/2}} \ right) {\ mathrm {/}} k} \ right]} \ right \}, $$

где В _м — мембранный потенциал, В _1/2 — это потенциал для полуактивации или полуготовности, а k — коэффициент обратной характеристики.τ _f и τ _s — быстрые и медленные константы времени инактивации I _Na . Одноканальные события записываются из ячеек с минимальным количеством каналов под патчем, чтобы гарантировать одноканальную запись. Одноканальная проводимость определялась путем регистрации более тысячи разверток в каждом состоянии на частоте 1 кГц, без дополнительной фильтрации. Программное обеспечение для анализа Clampfit использовалось для определения событий одного (уровень 1) и второго (уровень 2) уровня после вычитания емкости пипетки. Это позволило нам определить открытый уровень 1 и открытый уровень 2. После установления этих двух открытых уровней мы сегментировали записанные трассы на сегменты по 0,2 мс, что позволило нам захватывать и подсчитывать события закрытого, открытого уровня 1 или открытого уровня 2 для каждых 0,2 сегмент мс. Стробирование считалось одновременным или «связанным», когда оно достигало второго уровня в пределах 0,4 мс (два сегмента), см. Рис. 6c, показывающий разницу между связью или одновременным, в отличие от несвязанного стека или неодновременного.

Использование высокого внешнего калия для обнуления мембранного потенциала покоя является стандартным подходом для одноканальной записи.Раствор с высоким содержанием калия приблизительно обнуляет мембранный потенциал покоя всей ячейки, следовательно, напряжение между электродом сравнения в ванне и измерительным электродом в пипетке равно или близко к напряжению, приложенному усилителем в режиме фиксации напряжения. Таким образом, чтобы достичь удерживающего потенциала -120 мВ, мы применяем +120 мВ, а для получения ступенчатого импульса -40 мВ мы применяем +40 мВ.

Биномиальный анализ

Клетки HEK293 трансфецировали различными соотношениями WT и мутантной кДНК.Затем записываются отношения тока и напряжения. Пиковые плотности тока при -20 мВ нормализуются только для WT (или S460A) и наносятся на график для каждого отношения. Теоретические кривые рассчитываются с использованием биномиального или трехчленного уравнения с учетом вероятности того, как различные субъединицы могут собираться в олигомере. Например, для стехиометрии димера есть четыре возможности: димер молекулы WT, димер мутантных молекул, но также ассоциация мутант / WT и WT / мутант.

Для теоретических кривых DN мы можем смоделировать их следующим образом:

Для теоретической кривой DN димера: y = (1 — x ) ² где

y = нормализованная пиковая плотность тока кривой I / V (нормализованная к 100% функциональному блоку)

x = соотношение трансфицированных плазмид DN (от 0 до 1)

Это уравнение предполагает случайную сборку димерных субъединиц, так что только две функциональные субъединицы вместе производят ток.

Однако, если два канала, WT и мутант, независимы друг от друга (не димеры), ток будет уменьшаться линейно с относительным I _Na = y = (1 — x ), как мы наблюдали, когда мы разъединили димер в присутствии дифопеина или мутанта S460A. Это соответствует теоретической кривой мономера.

Для теоретической кривой DN тримера уравнение:

y = (1− x ) ³ с такими же y и x , как указано выше.

Экстракция белка

Экстракцию белка проводили через 48 часов после трансфекции клеток HEK293 с помощью различных конструкций натриевых каналов. Клетки промывали PBS и лизировали в течение 30 мин на льду в буфере для лизиса (20 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 110 мМ K-ацетат, pH 7,4, 1 мМ MgCl ₂ , 0,1 мкМ CaCl ₂ 1 % Triton X-100, 1 мМ PMSF, 0,7 мкг / мл ^-1 Пепстатин и полный коктейль ингибитора протеазы добавляли в буфер для лизиса (Roche, Германия). Растворимые фракции центрифугировали при 14000 g (4 ° C) в течение 4 мин., затем использовались для экспериментов.Концентрации белка измеряли в двух экземплярах с использованием анализа Брэдфорда со стандартной кривой BSA. Выделение мембранного белка для экспериментов по совместной иммунопреципитации выполняли следующим образом: клетки промывали 3 раза в 1X PBS. Клетки ресуспендировали в 3 объемах 0,3 М сахарозы / 10 мМ фосфата натрия плюс AEBSF и полный коктейль ингибиторов протеазы. Клетки обрабатывают ультразвуком, а затем инкубируют на льду в течение 30 минут с перемешиванием на вортексе каждые 5 минут. Клетки осаждают центрифугированием при 2800 об / мин. в течение 10 мин при 4 ° C для разделения ядер и мусора.Супернатант собирают и центрифугируют при 8800 об / мин. на 10 мин. Супернатант собирают и центрифугируют при 18000 об / мин. в течение 60 мин при 4 ° C. Осадок содержит мембранные белки, его ресуспендируют в буфере для лизиса и инкубируют на льду в течение 10 минут с перемешиванием на вортексе каждые 2 минуты. Затем раствор центрифугируют при 13000 об / мин. в течение 5 мин при 4 ° C. Супернатант содержит растворимые мембранные белки ³⁵ .

Коиммунопреципитация

Magnetic Dynabeads (Dynal, Норвегия) дважды промывали 25 мМ лимонной кислоты, 50 мМ Na ₂ HPO ₄ , pH 5, инкубировали с мышиным анти-GFP (Clontech, JL-8 ) или крысиные анти-HA (Roche), или pan 14-3-3 (H-8) из антител Santa Cruz Biotechnology, в течение 2 ч при комнатной температуре, снова трижды промывали 25 мМ лимонной кислотой, 50 мМ Na ₂ HPO ₄ , Твин 0.1%, и инкубировали с предварительно очищенными образцами лизатов (всего 400 мг белка) при вращении в течение ночи при 4 ° C. Гранулы трижды промывали буфером для лизиса, а затем белки элюировали буфером для образцов Лэммли при 37 ° C в течение 30 мин при перемешивании и анализировали вестерн-блоттингом.

Вестерн-блоттинг

Анализировали гели 10% акриламида SDS-PAGE. Затем белки переносятся из гелей на нитроцеллюлозную мембрану, и затем мембрану инкубируют с различными первичными антителами: мышиными анти-GFP (1: 1000 Clontech, JL-8), крысиными анти-HA (1: 1000, Roche), кроличьи поликлональные антитела NavPan к натриевым каналам (1: 500, Millipore), актин (Sigma-Aldrich Cat # A4700, 1: 1000), hERG ¹³ (1: 2000) и трансферрин (1: 1000, Sigma-Aldrich Cat # GW20009F).Связанные антитела детектировали с использованием вторичных козьих антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (1: 5000, Santa Cruz Biotechnology), и визуализировали белковые сигналы с использованием субстрата SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce).

Эксперименты по сшиванию

Эксперименты по сшиванию белков проводили с использованием DSS (дисукцинимидил суберат, Thermo Fisher Scientific), нерасщепляемого и проницаемого для мембраны сшивающего агента в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, сшивание Nav1.5, Nav1.1, Nav1.2, hERG и трансферрин, экспрессируемые в клетках HEK293, выполняли до лизиса клеток, чтобы позволить идентифицировать взаимодействие между α-субъединицами натриевых каналов. Время инкубации при перекрестном сшивании варьировалось от 10 до 20 мин. В качестве отрицательного контроля использовали образцы, которые были подвергнуты воздействию всех тех же растворов и обработки без сшивающего агента. Эти образцы помечены как ДМСО / без ДСС на разных гелях. После выделения белка проводили вестерн-блоттинг (как указано выше). Для оценки размера использовалась белковая лестница Hi-Mark Pre-Stained (Thermo Fisher Scientific).

TIRF / FRET

Клетки HEK293 помещали на покровные стекла и трансфицировали 0,3 мкг pECFP-N3- SCN5A и 0,3 мкг pcDNA3.1-YFP- SCN5A . Эксперименты по флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF) и флуоресцентному резонансному переносу энергии (FRET) проводились на инвертированном микроскопе Olympus IX71 с возможностями FRET ¹¹ , дополненном двухстрочной системой Olympus TIRFM с объективом 60 × TIRFM ³⁶ . Записи были получены с помощью устройства с зарядовой связью ORCA-ER Hamamatsu (12 бит) под управлением программного обеспечения SLIDEBOOK (Intelligent Imaging Innovations, Денвер, Колорадо).Изображения были проанализированы с помощью ImageJ с использованием плагина FRETCALC. FRETc был рассчитан как FRET — (a × CFP) — (b × YFP), где коэффициент перекрестных помех составляет a = 0,29 и b = 0,04.

SiMPull

Шестилуночные планшеты с клетками HEK293 трансфицировали Polyfect, как описано выше для патч-зажима. Использовали 0,4 мкг pcDNA3.1-GFP-Na _v 1,5, pCLC3sGFP (Addgene) или pcDNA3.1-Kv4.3-GFP. Клетки собирали через 24 часа после трансфекции и лизировали с использованием буфера CHAPS (0.4% CHAPS, 20 мМ Трис-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,5 мМ TCEP с коктейлем ингибиторов протеазы). Антитела против GFP были иммобилизованы на пассивированных стеклянных покровных стеклах, и лизаты, содержащие GFP-меченые каналы, перфузировались поверх них. Используя программное обеспечение для видео и визуализацию TIRF, были подсчитаны шаги фотообесцвечивания для количественного определения количества флуорофоров, присутствующих в каждом комплексе, что позволило напрямую измерить стехиометрию ³⁷ .

Кардиомиоциты человеческого происхождения

Кардиомиоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (iCell Cardiomyocytes; Cellular Dynamics International), поддерживались в предоставленной iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium (Cellular Dynamics International) при 93% увлажненном воздухе и 7% CO2 при 37 ° C .20 000–40 000 клеток помещали на покровные стекла, покрытые 0,1% желатином, и использовали для экспериментов с патч-зажимом ³⁵ .

Статистический анализ

Результаты представлены как средние значения ± SEM. Статистическую значимость определяли с использованием программного обеспечения SigmaPlot с помощью t-критерия Стьюдента или ANOVA, в зависимости от ситуации. Значимость была получена для P <0,05. Группы были проверены на дисперсию, и все считались равными. Для большинства результатов представленные данные соответствуют репрезентативным примерам минимум трех экспериментов.Мы определили необходимый размер группы на основе оценок дисперсии и минимально обнаруживаемых различий между группами в соответствии с нашими предыдущими записями в клетках HEK293 и iCells.

Доступность данных

Наборы данных, созданные в этой рукописи, доступны у соответствующих авторов по разумному запросу.

Сравнение составов буферов для лизиса, содержащих от 4 до 6 мкМ GITC, буфера для внешнего лизиса Roche и буфера для лизиса Qiagen RTL

Страница 5 из 6

может быть протестирован, в частности составы

со ступенчатым увеличением% мас. / Об.

Тритон Х-100.Работа продолжается, чтобы проверить, влияют ли вариации

в молярности трис-HCl на производительность лизисного буфера

. Наивысшим приоритетом является получение сообщения

о том, что этот 4 M GITC буфер для лизиса

работает хорошо. Кроме того, мы заметили, что буфер для лизиса RLT

компании Qiagen из наборов RNeasy очень хорошо работал с системами и процессами

, используемыми в диагностической лаборатории

в больнице Коркского университета.

Когда началось тестирование на Covid-19, отдельные

лабораторий диагностической микробиологии в

Ирландии согласились не накапливать какие-либо из своих

ресурсов из других лабораторий

больниц Ирландии. Через свою профессиональную организацию,

Академия клинических наук и Лаборатория

Медицина, они проводили ежедневные встречи (используя

WhatsApp) для решения проблем в группе, где требовалось

.

Обычно больничные лаборатории покупают реагенты

, которые позволяют им сконцентрироваться на бизнесе

диагностики пациентов, а приготовление собственных

реагентов — редкость. Однако предметом особого беспокойства для

была неожиданная нехватка

одного реагента (буфера для лизиса), необходимого для лизиса

вируса, вызывающего COVID-19, для облегчения экстракции РНК

и последующего обнаружения.В трудные времена

обществу необходимо объединить свои ресурсы и опыт

для наилучшего воздействия, и это тематическое исследование и проверка

представляет собой щедрый

и быстрый ответ научного сообщества,

, когда к нему обращается Академия клинических исследований. и

Лабораторная медицина, в то время как крупные

международные коммерческие компании не могли

поставлять этот жизненно важный реагент.

В разгар этих совместных усилий

ученых-медиков и

ученых-медиков в других частях Ирландии по очереди сообщают результаты своей проверки.

Частью групповых усилий в описываемом случае

являются усилия двух ученых из Университета

Лимерика, которые подготовили документацию по оценке риска

для отчета, а

одновременно составили буфер и предоставили

ближайшая к ним больничная лаборатория при университете

Госпиталь Лимерик.

В экстренной ситуации ирландские ученые, ученые

и биофарма объединили

опыта, технических ноу-хау, химикатов из

своих исследовательских лабораторий, своих помещений, времени, координации

и коммуникативных навыков наряду с решимостью

разработать подходящую замену буфера для лизиса

в масштабе менее чем за две недели.Подобно больничным лабораториям

, лаборатории третьего уровня

полагаются на покупку готовых наборов и реагентов

для ускорения своих исследований. К счастью,

сохранение знаний о химическом составе буферов

среди ученых

позволило им составить свои собственные реагенты из

сырья.

Благодарности

Авторы выражают благодарность коллегам из

Технологического института Слайго и

Отделения клинической микробиологии Университета

College Hospital, Лимерик за их ценную помощь

при рассмотрении составов буфера для лизиса

.Кроме того, д-р Джон О’Каллаган, старший технический специалист

, Школа микробиологии, UCC для технической помощи

на этапах UCC разработки и подготовки

(и для предоставления

буфера Qiagen), д-р Юэн Маллинз из Teagasc для

источников и обмена реагентами, а также д-р Даррен

Кроули и д-р Иоган Кейси, которые принимали участие

в увеличенной подготовке буфера в Eli Lilly.

Каталожные номера

Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL,

Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J.Rapid

и простой метод очистки нуклеиновых кислот.

Журнал клинической микробиологии. 1990; 28 (3): 495–

503.

Chomczynski P & Sacchi N. Одностадийный метод выделения

РНК кислотной экстракцией тиоцианатом гуанидиния —

фенол-хлороформом. Аналитический

Биохимия 1987; 162, (1): 156-159.

Хуэй Хэ, Ронгкун Ли, Йи Чен и др., Интегрированная ДНК

и экстракция РНК с использованием магнитных шариков из

вирусных патогенов, вызывающих острые респираторные

инфекции.Научные отчеты 2017; 7: 45199.

.CC-BY-NC-ND 4.0 Автор / спонсор международной лицензии. Он доступен под номером

. Владельцем авторских прав на этот препринт (который не рецензировался) является. https://doi.org/10.1101/2020.04.05.026435doi: bioRxiv препринт

Aqualisa Midas 110 Термостатический душ с регулируемой головкой

{{#if sale_price_discounted}} {{price sale_price_display}} {{sale_pricing}} {{/если}}

{{#if sale_price_discounted}} {{price sale_price_discounted}} {{еще}} {{price sale_price_display}} {{/если}} {{sale_pricing}}

Добавить в корзину

Цена по акции — скидка {{Discount}} при совместной покупке

{{/каждый второй}} {{/каждый}}

1. Душ
2. Смесители для душа
3. Бар Душевые
4. Душевые кабины Aqualisa Bar

У Plumbworld самая низкая цена на этот товар!