Отзывы о фасадах сидак: Отзывы о Мебельной фабрике Сидак-СП на Заводской улице — Магазины

Содержание

Отзывы о СИДЭЯ-НОВОСИБИРСК, ООО, официальный дистрибьютор Сидак-СП, ООО Новосибирск: комментарии, оценки пользователей, статистика

2.8 cредняя оценка на основе 6 отзывов.

Изучите 6 отзывов клиентов о СИДЭЯ-НОВОСИБИРСК, ООО, официальный дистрибьютор Сидак-СП, ООО. Если мнений много, изучите, как меняются оценки людей со временем. Качество товаров и услуг может со временем измениться.

17.12.2016

Анонимный пользователь

Оценка: 1

Здравствуйте, уважаемые читатели Флампа и, в особенности, руководители мебельных компаний, которые планируютработать с фасадами Сидак. Рекомендую сто раз подумать, прежде чем брать на себя такую ответственность. Ответственность перед Вашими заказчиками, которые благодаря отвратительной организации работы в Сидея-Новосибирск вовремя не получат свою мебель, либо получат фасады не того цвета, не в заказанном количестве или выполненные с нарушением условий заявки. Например: у них можно заказать комплект фасадов на один заказ с одинаковой фрезеровкой, а получить фасады с разной фрезеровкой и переделки потом ждать больше месяца, или получить комплект карнизов на один заказ с разным профилем. ..выставления счетов можно ждать до десяти дней — а это, в итоге, прикручивается к сроку выполнениия заказа…Короче, заплатив несколько раз неустойку клиентам, из-за их нерадивости мы были вынуждены отказаться от фасадов данного производителя. Кстати разговор с директором в Новосибирске ничего не даёт. Ей АБСОЛЮТНО ВСЁ РАВНО как именно работает её организация, лишь бы деньги несли как говорится…Печально. Никогда их менеджеры не извиняются за свои ошибки, счета правильно выписать не в состоянии ни с первого, ни даже со второго раза, проверять за ними надо всё как за детьми малыми. СОВЕРШЕННО не заинтересованы в результате своего труда ни менеджеры, ни работники склада, которые отгружают чётрый акрилайн вместо белого) Листы акрилайна мы у них покупаем, но и тут не без сюрпризов: якобы устойчивый к царапинам акрилайн отгружают вместо ALT просто AL, когда это видит клиент поливает нас на этом же флампе как попало( а мы снимая плёнку с акрилайна у клиента уже (как и положено, никто не бедет транспортировать такой материал без защитной плёнки) когда кухня изготовлена и установлена что должны делать? Вопрос директору Сидеи? Ответа, конечно, я думаю не будет…это вам к размышлению, уважаемые мебельшщики…Да плюс, можно оплатить листы акрилайна и кромку в глянце (что указано в заявке и счёте), получить от Сидеи сто звонков с упорным втюхиванием матовового материала вместо глянцевого, по-тому как они уже продали и оплаченный вами акрилайн и кромку кому-то ещё…а вы теперь ждите новой поставки вместе с вашим заказчиком, поскольку ни их собственная (Сидеи), ни ваша репутация как мебельщика сотрудников Сидеи не интересует, а уж конечный потребитель, для которого мы все собственно и работаем для Сидеи вообще величина абстрактная, про чувства да и само существование этих людей, которые, на минуточку, и платят им деньги ни руководство, ни сотрудники Сидеи не думают.
Так вот, я уже много лет веду свой бизнес, руководствуясь принципом «поступай с людьми так, как хочешь, чтобы они поступали с тобой», поэтому моя компания прежила все кризисы и переживёт ещё, а сотрудникам и руководителю Сидеи под Новый Год я искренне желаю : Пусть люди поступают с вами так, как вы того заслуживаете, а именно так — как вы с ними поступаете. Эффект бумеранга никто не отменял…да и слухами земля полнится…ди и рехау выпустил акрилайн не хуже вашего и торгует им приличная организация, которая хорошо относится к своим клиентам, вот только сделают покрытие устойчивое к царапинам как у вас (а это у них в ближайших планах) и никто к вам не пойдёт, ну уж о плёночных фасадах и крашенных я не говорю — фасады ГОРАЗДО лучшего качества производят и в Сибири, так что нет смысла ваши фвсады с вашим отсутствием сервиса рассматривать даже как просто возможный вариант.

18.07.2016

Анонимный пользователь

Оценка: 5

Недавно с мужем купили новую квартиру. Конечно встал вопрос с покупкой кухни. Такого выбора фасадов я не встречала нигде. Посмотрели каждый образец, Я не профессионал, но внешне все сделано отлично. Качество мне понравилось.
Дизайнер Тамара задала мне кучу вопросов. В итоге подобрали несколько вариантов. Очень порадовало, что можно найти очень похожие внешне фасады, но разные по цене.
Не понимаю, как могут существовать так долго компании, если верить негативным слухам. Тем более такие крупные. Они бы давно уже закрылись.
Сейчас немного подумаем, оценим свои возможности и обязательно вернемся за покупкой.

16.06.2016

Анонимный пользователь

Оценка: 4

Почитал отзывы о компании, не понял почему пишут, что они не работают с обычными покупателями не юр. лицами? во вторник были в Красном мамонте, заходили к ним в салон, работают они с розницей, какого-то хамства или принебрежительного отношения к себе не заметил, вежливая девушка консультант рассказала о продукции, показала каталоги, помогла с выбором, сделала предварительный расчет, ничево криминального. Из салона ушли на позитиве, решил посмотреть отзывы, теперь буду думать, но пока все таки склоняюсь в сторону покупки.

06.03.2016

Анонимный пользователь

Оценка: 1

Непрофессионалы! Мы работаем с Новосибирским представительством- очень сложно работать с этой фирмой! Пленка на фасадах через год использования отслаивается, менеджеры специально тянут время, требуя всевозможные бумажки, чтобы закончился гарантийный период. За все время работы из 9 претензий были полностью удовлетворены только 2 !!! После выставления счета и оплаты этого счета меняют стоимость фасадов, якобы в связи с повышением цен!!! Упаковка отвратительная! У такой крупной компании нет денег на гофракартон! часто фасады приходят с повреждениями. Были случаи, когда наши фасады уезжали в другой город! Менеджеры безответственные и непрофессиональные работники. на запросы отвечают не всегда сразу, иногда вообще не считают нужным отвечать. Больше работать с Сидаком, и в частности, с их новосибирским представительством, не будем и другим НЕ СОВЕТУЕМ!!!

05.01.2016

Анонимный пользователь

Оценка: 1

Прежде чем начать работать с компанией Сидак, подумайте, готовы ли вы отвечать за безответственность работников этой фирмы перед своими клиентами. Я свою кухню ждала уже три месяца, а все потому что фасады сначала шли очень долго, потом были упакованы некачественно, в следствие чего пришли с дефектом, после чего они согласились полностью переделать все. В результате фасады были отправлены назад, но по какой то причине их решили отреставрировать, а не переделывать, хотя это могли сделать и в нашем городе. В итоге постоянные задержки с отправками и абсолютно бесконтрольная работа менеджера, которая не знает как вести работу с клиентами! Можно было бы предложить скидку в качестве компенсации за такие неудобства, но нет, зачем?! Эта фирма абсолютно не клиенториентированна, потому что не им отчитываться перед людьми, а фирмам, которые готовы работать с ними и получать за них негативные отзывы и негодование клиентов!

26.06.2015

Анонимный пользователь

Оценка: 5

Недавно с мужем выбирали фасады для нашей кухни, объехали всех производителей фасадов и остановились на компании Сидак. Очень понравился выставочный зал, где представлено много фасадов. Девочки все грамотно и доступно объяснили и поэтому мы решили заказать фасады именно в этой компании. Выбрали фасады из акрилайна. Девушка наглядно продемонстрировала, что эти фасады не ЦАРАПАЮТСЯ. Сейчас любуемся на нашу кухню и ничуть не пожалели, что обратились в компанию Сидак. Хороших Вам продаж и понимающих клиентов!!!!

Предлагаем аналитику отзывов о СИДЭЯ-НОВОСИБИРСК — исследование мнений и статистика распределения по баллам расположены ниже.

ООО официальный дистрибьютор Сидак-СП ООО СИДЭЯ-НОВОСИБИРСК: исследование 6 отзывов сотрудников, разбор мнений покупателей, работников на сайте novosibirsk.sprav.co. Рейтинг: 2.8 из 5.

мебельные фасады Сидак-СП отзывы, Мінск, вуліца Прамысловая, 6Б/1


СидЭвис — мебельные фасады Сидак-СП

СидЭвис — мебельные фасады Сидак-СП отзывы

4

Дмитрий Гаврилов

25 ноября 2019 в 13:06

Технология производства крашенных фасадов:
Дмитрий, грунт-пленка используется для облицовывания мебельных фасадов, профилей и прочих погонажных изделий для последующей покраски, лакировки или патинирования. Использование данной грунт-пленки дает преимущества: упрощение технологического процесса по грунтованию изделия перед покраской, сокращение расходов на подготовку к окраске, материал хорошо прячет все изъяны МДФ, допускает отделку разнообразными системами лаков и красок, поверхность легко шлифуется. Данный материал стабильный по цвету, заявленной толщине и химическому составу. УФ стабилизаторы включены в состав пленки, что исключает изменение цвета в основе фасада или профиля в конечном изделии через какое-то время.
Плоские фасады имеются ввиду не по глубине фрезеровки, а именно как не гнутые (без радиуса).

В технической информации, как видите, наличие грунт-пленки прописано.
Что касается внешнего вида пилястры в разрезе, то мы отправили фото с комментариями в технический отдел фабрики.

СидЭвис

07 октября 2018 в 17:26

SIDEVIS — лучшая компания в Беларуси по ассортименту мебельных фасадов и акриловых плит производства фабрики SIDAK

Александр

07 октября 2018 в 2:33

Эксклюзивный дистрибьютор по фасадам и комплектам мебели Сидак-СП в Беларуси. Выставочный зал впечатляет, таких я в Минске не видел. Товары качественные, модные и по хорошим ценам.

Сергей

30 сентября 2018 в 7:23

Высококвалифицированная команда менеджеров
Прекрасный продукт — мебельные фасады и акриловые плитные материалы фабрики SIDAK
Отличное соотношение по цене/качеству

Очень четкие сроки выполнения заказов 10-14 дней.
Широкий ассортимент, постоянно обновляется
Хорошая рекламная поддержка.
Современное техническое сопровождение продаж — можно самому просчитывать стоимость заказов on-line.
Удобная логистика расположения склад/офис

Добавить отзыв

Вакансии компании Сидак

Компания Sidak — современное предприятие, работающее с 1998 г., российский лидер по производству мебельных фасадов и листовых материалов европейского качества как по стандартным программам, так и по индивидуальным заказам для удовлетворения потребностей рынка. ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ 1998 год. Начало деятельности как предприятия по производству механизмов транcформации для мягкой мебели по бельгийской технологии в поселке Сиверский под Петербургом. 1999 год. Открыта фабрика по производству мебельных фасадов. Освоение нового вида продукции — мебельных фасадов из МДФ, покрытых пленками ПВХ и ПЭТ в технологии трехмерного прессования. Для этих целей было закуплено новейшее оборудование ведущих мировых производителей из Германии, Италии и США. Главным принципом работы стало качество выпускаемой продукции, которое не должно было уступать ведущим зарубежным производителям. 2002 год. В Санкт-Петербурге открыто обособленное подразделение Сидак-СП по Северо-Западному региону РФ. 2003 год. Реконструировано здание под новую производственную площадь, технологическая линия оснащена дополнительным оборудованием для расширения объема производства мебельных фасадов. Компания получила сертификат на соответствие требованиям стандарта ISO 9001:2000 в области управления предприятием. В Московской области открыто обособленное подразделение Сидак-СП по Центральному и Приволжскому региону РФ. 2005 год. На рынок последовательно выводятся новые продукты в технологии плоскостного ламинирования. Это программы Acryline (2005), Glossline (2007), Leatherline (2007), Glossform (2008). 2006 год. Сидак-СП — первая российская компания, принявшая участие в самой актуальной европейской выставке производителей мебельных комплектующих ZOW в г.Бад Зальцуфлен (Германия). 2007 год. Для удовлетворения стремительно растущего спроса на продукцию в технологии трехмерного прессования запущен еще один производственный комплекс мощностью до 40 тыс.кв.м. изделий в месяц. 2008 год. Введена в эксплуатацию еще одна фабрика по производству эксклюзивной продукции — фасадов Acryline, Glossline, Leatherline, которая стала также логистическим центром для максимально быстрой обработки заказов. Открытие в Новосибирске обособленного подразделения Сидак-СП и современного складского комплекса, обслуживающего Сибирь и Дальний Восток. 2009 год. В целях оптимизации и актуализации существующей продукции проведен суббрендинг. Введены новые программы: Sidak-Original, Sidak-Select и Sidak-Contour. Разработан долгосрочный план внедрения новых технологий и актуальных продуктовых линеек. 2010 год. Расширение производственных мощностей. Ввод в эксплуатацию линии плоскостного ламинирования. Открытие линии по производству гнутых фасадов. Территориальное расширение компании, открытие нового обособленного подразделения и регионального склада в городе Екатеринбург. 2011 год. Значительное расширение ассортиментного ряда по всем направленниям. Введена новая программа: Sidak-Nature. Открыто новое обособленное подразделение Сидак-СП в Свердловской области. 2012 год. Запуск коллекций мебельных ручек и стекол витражного типа. Открытие обособленного подразделения Сидак-СП в Краснодарском крае. 2013 год. Планомерное расширение ассортимента 2014 год. Компания становится генеральным дистрибьютором продукции NIEMANN MOBELTEILE — ведущего немецкого производителя высококачественных плитных материалов, на всей территории ЕАЭС. Открытие нового обособленного подразделения в Ростове-на-Дону, а также начало сотрудничества с компанией СидЭвис в республике Беларусь.

Обзор Фасадов (9781468306873) — Предисловие Обзоры

Эрик Лундгрен
The Overlook Press (12 сентября 2013 г.)
Твердый переплет 25,95 долл. США (224 стр.)
978-1-4683-0687-3

Этот дебютный роман бросает вызов жанрам, в нем есть юмор и необычные персонажи.

В The Facades баснописец Эрик Лундгрен создал воображаемую городскую среду, в которую входят пропавший оперный певец, проповедник-евангелист и полицейский детектив по имени Оракул.Роман начинается с того, что Свен Норберг ищет свою жену Молли, любимую горожанами меццо-сопрано, которая исчезла однажды ночью, когда шла с репетиции оперы в местный гастроном. Место действия — Труд, город, «застрявший в длинной и ровной пустоте между двумя побережьями». Тон комический.

Trude, названный в честь одного из невидимых городов Итало Кальвино, имеет разрушающийся центр города с разбитыми витражами, темными переулками и особняками, забрызганными граффити. В распаде таится опасность, и жители не любят оставаться слишком поздно в одиночестве, но, как и в случае с исчезновением Молли, здесь нет срочности.Труд, как говорится в туристическом буклете, — это место, где можно заблудиться. Город выделяется несколькими зданиями, спроектированными австрийским архитектором-эмигрантом Клаусом Бернхардом. К ним относятся роскошный оперный театр с потолочной фреской Орфея и двухтонной люстрой; торговый центр Ringstrasse, главная туристическая достопримечательность города, с его центральным лабиринтом, «непонятым миллионам любителей кукурузы»; и шедевр Бернхарда, дом престарелых Traumhaus, где жители с плохой памятью постоянно переписывают свои мемуары.

Как и город, жизнь Норберга продолжает рушиться. Его сын-подросток отвергает экзистенциалистское мировоззрение Норберга и становится евангелистом. Полицейский детектив Маккриди и его помощник Оракул объявляют, что след Молли остыл. Затем Мартин Бриз, местный искусствовед, начинает вставлять в свою газетную колонку акростихи, намекающие на местонахождение Молли, и Норберг возобновляет свои поиски.

Эрик Лундгрен работает в публичной библиотеке в Сент-Луисе, и в своем дебютном романе он отвел специальное место библиотекарям.Когда мэр угрожает закрыть городские библиотеки, библиотекари из Центральной библиотеки бросают вызов мэрии и создают Тринадцать трудов. Главный библиотекарь является автором сборника рассказов «Медуза сегодня выглядит красиво », которую Молли читала перед своим исчезновением. Это подсказка или, как костюм Молли на Хэллоуин, когда пара встретилась, еще один отвлекающий маневр?

Как и лучшие рассказчики, Лундгрен понимает, что его работа — задавать вопросы, а не отвечать на них.И вопросы накапливаются. Молли похитили или она ушла от параноидального ненаблюдательного мужа? Фасады — это тайна, семейная драма или постмодернистская сказка? Этот изобретательный роман бросает вызов жанрам: он понравится читателям, которым нравится умная игра слов, странные персонажи и взгляд в недалекое будущее.

Рассмотрено Карен Экленд

Раскрытие информации: эта статья является не рекомендацией, а обзором.Издатель этой книги предоставил бесплатные копии книги для рецензирования их книги профессиональным рецензентом. Издатель не платил вознаграждение за этот обзор. Foreword Reviews рекомендует только те книги, которые нам нравятся. Foreword Magazine, Inc. раскрывает это в соответствии с 16 CFR Федеральной торговой комиссии, часть 255.

Сравнение методов проверки множественных гипотез в нейропсихологических исследованиях

Нейропсихология.Авторская рукопись; Доступен в PMC 2011 28 февраля.

Опубликовано в окончательной отредактированной форме AS:

PMCID: PMC3045855

NIHMSID: NIHMS268580

Richard E. Blakeley

Департамент биостатистики

, Университет Pittsburgh

Отдел Sati Mazumdar

факультета биостатистики Питтсбургского университета и факультета психиатрии Медицинского факультета Питтсбургского университета

Мэри Аманда Дью

Кафедра психиатрии Медицинского факультета Университета Питтсбурга и факультетов эпидемиологии и психологии Питтсбургского университета

Патрисия Р. .Houck

Кафедра психиатрии, Медицинский факультет Университета Питтсбурга

Гонг Танг

Кафедра биостатистики, Университет Питтсбурга

Charles F. Reynolds, III

Факультет психиатрии, Медицинский факультет Университета Питтсбурга

Merylh06

Медицинская школа Meryl Баттерс

Кафедра психиатрии, Медицинский факультет Университета Питтсбурга

Ричард Э. Блейксли, Кафедра биостатистики, Университет Питтсбурга;

Корреспонденцию, касающуюся этой статьи, следует направлять по адресу Richard Blakesley, 130 DeSoto Street, 306 Parran Hall, Pittsburgh, PA [email protected]Окончательная отредактированная версия этой статьи доступна по адресу Neuropsychology См. другие статьи в PMC, в которых цитируется опубликованная статья.

Abstract

Проверка гипотез с множественными исходами требует корректировок для контроля увеличения ошибок типа I, что снижает мощность обнаружения существенных различий. Поддержание заранее выбранного уровня ошибки типа I является сложной задачей, когда результаты коррелируют. Эта проблема касается многих областей исследований, в том числе нейропсихологических исследований, в которых распространены множественные взаимосвязанные меры оценки.Стандартные методы корректировки значений p включают методы Бонферрони, Сидака и методы класса передискретизации. В этом отчете авторы стремились разработать стратегию проверки множественных гипотез, чтобы максимизировать мощность при контроле ошибок типа I. Авторы провели анализ чувствительности, используя нейропсихологический набор данных, чтобы предложить относительное сравнение методов и симуляционное исследование для сравнения надежности методов в отношении различных моделей и величин корреляции между результатами.Результаты привели к тому, что они рекомендовали методы Хохберга и Хоммеля (повышающие модификации метода Бонферрони) для результатов со слабой корреляцией и метод понижения minP (метод, основанный на повторной выборке) для результатов с высокой корреляцией. Авторы отмечают предостережения относительно реализации этих методов с использованием доступного программного обеспечения.

Ключевые слова: множественная проверка гипотез, коррелированные исходы, частота ошибок по всей семье, p корректировка значений, данные о выполнении нейропсихологического теста

Заданная нейропсихологическая область, например исполнительная функция, состоит из множества взаимосвязанных подфункций, и часто все интересующие результаты подфункций подлежат проверке гипотез. При заданном α (критическом пороге) риск неправильного отклонения нулевой гипотезы, ошибки типа I, увеличивается по мере проверки большего количества гипотез. Это относится ко всем типам гипотез, включая набор двухгрупповых сравнений по нескольким результатам (например, различия между двумя группами по нескольким когнитивным показателям) или многогрупповые сравнения в рамках дисперсионного анализа (например,g., различия в когнитивных характеристиках между несколькими группами лечения и контрольной группой). В совокупности мы определяем эти проблемы как проблему множественности (Pocock, 1997).

Управление ошибкой типа I на желаемом уровне является статистической задачей, еще более осложненной коррелированными результатами, преобладающими в нейропсихологических данных. Внося коррективы для контроля ошибки типа I, мы увеличиваем риск неправильного принятия нулевой гипотезы, ошибки типа II. Другими словами, мы уменьшаем мощность.Неспособность контролировать ошибку типа I при изучении нескольких результатов может привести к ложным выводам, которые могут замедлить или увести в сторону ход исследования. Исследователям нужны стратегии, которые максимизируют мощность, обеспечивая при этом приемлемую частоту ошибок типа I.

Существует множество методов решения проблемы множественности. Некоторые методы основаны на неравенствах Бонферрони и Сидака (Сидак, 1967; Саймс, 1986). Эти методы корректируют значения α или значения p с использованием простых функций числа проверенных гипотез (Sankoh, Huque, & Dubey, 1997; Westfall & Young, 1993).Холм (1979), Хохберг (1988) и Хоммель (1988) разработали производные Бонферрони, включающие ступенчатые компоненты. Используя ранжированные значения p , пошаговые методы изменяют величину изменения в зависимости от порядка значений p . Математические доказательства упорядочивают эти методы от наименьшей к наибольшей мощности, как Bonferroni, Holm, Hochberg и Hommel (Hochberg, 1988; Hommel, 1989; Sankoh et al., 1997). Методы Tukey-Ciminera-Heyse (TCH), Dubey/Armitage-Parmar (D/AP) и методы корректировки R 2 (RSA) представляют собой одностадийные производные Сидака (Sankoh et al., 1997). Другой класс методов использует методологию передискретизации. Методы начального (одношагового) minP и понижающего minP корректируют значения p с использованием непараметрически оцененного нулевого распределения минимального значения p (Westfall & Young, 1993).

Методы класса Бонферрони и метод Сидака теоретически применимы только к независимым, некоррелированным результатам (Hochberg, 1988; Holm, 1979; Hommel, 1988; Westfall & Young, 1993). Методы D/AP и RSA включают меры корреляции (Sankoh et al., 1997), а методы класса повторной выборки включают корреляционные характеристики с помощью процедур начальной загрузки (Westfall & Young, 1993). Однако неясно, какие методы работают лучше при анализе коррелированных результатов. Теоретические и эмпирические сравнения этих p методов корректировки стоимости были ограничены широтой сравниваемых методов и изученных корреляционных структур (Hochberg & Benjamini, 1990; Hommel, 1988, 1989; Sankoh, D’Agostino, & Huque, 2003; Sankoh). и другие., 1997; Саймс, 1986). Мы стремились определить оптимальный метод (методы) для проверки множественных гипотез в нейропсихологических исследованиях.

Мы разделили эту статью на несколько разделов. Во-первых, мы приводим определения и иллюстрации методов корректировки стоимости 10 p . Далее мы описываем анализ чувствительности, определяемый как параллельное использование статистических методов для сравнения оценок, выводов гипотез и относительной правдоподобности выводов (Сальтелли, Чан и Скотт, 2000; Вербеке и Моленбергс, 2001).Используя набор нейропсихологических данных, мы сравниваем методы корректировки значения p с помощью скорректированного значения p и шаблонов выводов. После анализа чувствительности мы детализируем имитационное исследование, которое по определению позволяет исследовать интересующие показатели в контролируемых условиях. Мы исследовали ошибку типа I и мощность методов корректировки значений p в условиях систематического ряда корреляции и нулевой гипотезы. Это позволяет нам сравнивать эффективность методов относительно условий моделирования, то есть когда истина известна.Наконец, мы предлагаем рекомендации по использованию этих методов при анализе нескольких коррелированных результатов.

Метод корректировки значения p

Несколько методов корректировки тестирования могут быть сформулированы как корректировка значения p (с более высокими скорректированными значениями p ) или корректировка значения α (с более низкими скорректированными значениями α). Мы фокусируемся на формулах метода корректировки значений p , потому что скорректированные значения p позволяют проводить прямую интерпретацию по отношению к выбранному значению α и устраняют необходимость в поисковых таблицах или знании сложных правил отклонения гипотез (Westfall & Young, 1993; Wright, 1992).Кроме того, скорректированные значения α не поддерживаются статистическим программным обеспечением.

Мы описываем методы, предполагающие набор нейропсихологических данных с N участников, принадлежащих к одной из двух групп, с M результатами, наблюдаемыми для каждого участника. Цель состоит в том, чтобы определить, какие результаты различаются между группами, используя тесты t с двумя выборками. Для j -го исхода, где j = {1, 2,…, M }, существует нулевая гипотеза и наблюдаемое значение p , полученное в результате проверки нулевой гипотезы, обозначенное как V ( j ), H 0 j и p j соответственно.Наблюдаемые значения p расположены так, что p 1 ≥…≥ p j ≥…≥ p M . Для каждого результата мы проверяем нулевую гипотезу об отсутствии различий между группами, то есть группы происходят из одной и той же совокупности. Для любого метода мы рассчитываем последовательность скорректированных значений p , в которой мы обозначаем p aj как скорректированное значение p , соответствующее p j .

Метод класса Бонферрони

Параметрические методы класса Бонферрони состоят из метода Бонферрони и его производных. Метод Бонферрони, определяемый как p aj = min{ Mp j , 1}, увеличивает каждое значение p в M раз до максимального значения, равного 1. Holm (1979) и Hochberg (1988) усовершенствовал этот одноэтапный подход с помощью пошаговой корректировки, которая последовательно корректирует значения p и поддерживает наблюдаемый порядок значений p .Пошаговый подход Холма начинается с корректировки наименьшего значения p p M как p aM = min{ Mp M , 1}. Для каждого последующего p j , где j = { M − 1, M − 2,…, 1}, p aj определяется как min{ 17 jp 10 16 j 17 jp , 1} если min{ jp j , 1} больше или равно всем ранее скорректированным значениям p , p aM по p 1 a ( ) .В противном случае это максимальное из этих ранее скорректированных значений p . Поэтому значения Holm p определим как p aj = min{1, max[ jp j , ( j + 1) p , 6 Mp M ]}, все из которых находятся в диапазоне от 0 до 1. В методе Хохберга используется ступенчатый подход, такой, что p aj = min{1 p 1 , 2 p 2 , …, jp j }.В отличие от метода Холма, уравнивание начинается с наибольшего значения p , p a 1 = 1 p 1 , и доходит до более значительных значений p 1 9, где 10 каждое последующее AJ — минимум JP J и ранее скорректированные значения P , P A 1 P A ( j — 1) .

Метод Hommel (1988) является производным от глобального теста Simes (1986), который является производным от метода Бонферрони.Для подмножества S нулевые гипотезы, 1 ≤ S м , мы определяем p Simes = min {(( S / S ) p 1 , …, ( S /[ S i + 1]) p i , …, ( S /1) p S } 1, для 90, 2 i 1 0 …, S }, где p i s — это упорядоченные p значения, соответствующие S гипотезам внутри подмножества.Hommel расширил этот метод, разрешив индивидуальные скорректированные значения p , определив p aj как максимум p Simes , рассчитанный для всех подмножеств гипотез, содержащих j -ю нулевую гипотезу, H 7 1 0 7 1 0 7 . Рассмотрим простой случай M = 2 гипотезы, H 01 и H 02 . Мы рассчитываем P A 1 в качестве максимума значений Simes P для подмножеств {H 01 } и {H 01 , H 02 }, такие, что P a 1 = max[(1/1) p 1 , min{(2/2) p 1 , (2/1) p 2 }].Мы вычисляем p a 2 аналогично с подмножествами {H 02 } и {H 01 , H 02 }. Райт (1992) представил наглядный пример и эффективный алгоритм для вычисления значения Hommel p .

Метод класса Сидака

Метод Сидака и его производные составляют параметрические методы класса Сидака. Метод Sidak определяет P AJ = 1 — (1 — P J ) M , который примерно равен MP J для небольших значений P J , напоминающий метод Бонферрони (Westfall & Young, 1993).Подобно методу Бонферрони, метод Сидака уменьшает ошибку типа I при наличии M проверок гипотез с независимыми результатами. Производные сидак имеют общую корректировку P , P AJ = 1 — (1 — P J ) G ( J ) , где г ( j ) — некоторая функция , определенная для каждого метода с 1 ≤ g ( j ) ≤ M . Некоторые производные Сидака определяют g ( j ) как зависимость от мер корреляции между исходами, где g ( j ) будет находиться в диапазоне от M для полностью некоррелированных исходов, до 1 для полностью коррелированных исходов.В свою очередь, величина корректировки значения p будет варьироваться от максимальной корректировки (уровень Сидака) до полного отсутствия корректировки.

Метод TCH определяет g ( j ) = √ M (Sankoh et al., 1997). Методы D/AP и RSA включают меры корреляции между исходами (Sankoh et al., 1997). j скорректированное значение D/AP p рассчитывается с использованием средней корреляции между j исходом и оставшимися M — 1 исходами, обозначенной средним значением.ρ( j ), такое, что г ( j ) = M 1 − среднее значение ρ( j ) . j th скорректированное значение RSA p использует значение R 2 из линейной регрессии без пересечений с переменной j th в качестве результата и оставшимися M − 1 переменными в качестве предикторов. .

Методы класса повторной выборки

Методы класса повторной выборки используют непараметрический подход к корректировке значений p . Мы рассмотрели бутстреп-варианты методов minP и step-down minP (sd.minP), предложенных Westfall and Young (1993). Метод minP определяет p aj = P [ X p j | X ~ minP(1, …, M )], вероятность наблюдения случайной величины X столь же экстремальной, как p j , где X соответствует эмпирическому нулевому распределению минимума p значение.Это похоже на вычисление значения p с использованием статистики значений z по сравнению со стандартным нормальным распределением, за исключением того, что распределение X получается путем повторной выборки. Мы генерируем распределение X по следующему алгоритму. Предположим, исходный набор данных содержит M результатов для каждого из N участников. Мы преобразуем исходный набор данных, центрируя все наблюдения с помощью средств, специфичных для группы и результата.Затем мы создаем бутстрап-выборку с N наблюдений путем выборки векторов наблюдений с заменой из этого набора данных со средним центром. Затем мы вычисляем p значений, проводя тесты гипотез для каждой выборки начальной загрузки. Эти значения M p считаются вектором наблюдения матрицы, состоящей из результатов B (1) по B ( M ), где B ( j ) — это p значений, соответствующих исходу. V ( j ) набора данных начальной загрузки.В отличие от значений p , рассчитанных на основе исходного набора данных, эти значения p не переупорядочиваются по рангу. Всего генерируется N boot наборов данных bootstrap, создавая N boot наблюдений в каждом B ( j ). Минимальное значение p из каждого вектора наблюдения определяет значения N boot эмпирического нулевого распределения minP для метода minP, из которых рассчитываются скорректированные значения p .

Метод sd.minP изменяет этот общий алгоритм, используя разные эмпирические распределения для каждого p j . Матрица с исходами от B (1) до B ( j ) вычисляется, как и раньше. Для p j мы формируем эмпирическое нулевое распределение minP из минимальных p значений, не из всех векторов наблюдения с исходами B (1) по B ( M ), а из подмножества соответствующие исходам B (1) по B ( j ), и определить значения P [ X p j | X ~ minP(1, …, j )].Последний шаг метода sd.minP представляет собой пошаговую процедуру, обеспечивающую наблюдаемый порядок значений p , как и в методе Холма. То есть p aj является максимальным значением P [ X p j | X ~ minP(1, …, j )] и значения P [ X p j + 1 | X ~ minP(1,…, j + 1)] до P [ X p M | X ~ minP(1, …, M )] .

Иллюстративный пример

Мы демонстрируем эти методы на иллюстративном примере со значениями, приведенными в . На практике мы рассчитывали бы большинство этих скорректированных значений p с помощью эффективных компьютерных алгоритмов, доступных в нескольких статистических пакетах, включая R (R Development Core Team, 2006) и программное обеспечение SAS/STAT (SAS Institute Inc., 2002–2006). Предположим, мы проводим двухвыборочные t тестов с M = 4 исходами и наблюдаем упорядоченные p значения p 1 = 0.3587, p 2 = 0,1663, p 3 = 0,1365 и p 4 = 0,0117. Используя метод Бонферрони, каждое из этих нескорректированных значений p умножается на 4, что дает значения 1,4348, 0,6653, 0,5462 и 0,0470 соответственно. По функции минимума p a 1 устанавливается на 1, а не на 1,4348, обеспечивая скорректированные значения p между 0 и 1.

Таблица 1

Класс и метод

90 795 9082
Бонферрони Сидака Ресэмплирование



Наблюдаемые Бонферрони Холм Хехберга Хоммел Сидака ТЧ Д/АП РСА минП сд.MINP
0,3587 1,0000 0,4096 0,3587 0,3587 0,8309 0,5887 0,6622 0,7362 0,7980 0,3616
0,1663 0,6653 0,4096 0.3326 0.3326 0.5169 0.3050 0.3448 0.3919 0.4749 0.3328
0.1365 +0,5462 0,4096 0,3326 0,2731 0,4441 0,2544 0,3017 0,3486 0,4055 0,3328
0,0117 0,0470 0,0470 0,0470 0,0470 0.0462 0.0234 0.0234 0,0274 0,0323 0,0434 0,0434 0.0434

Методы Holm (1979) и Hochberg (1988) начинаются с вычисления значений, в которых JP J , которые являются 0.3587, 0,3326, 0,4096 и 0,0470. Это потенциальные скорректированные значения p , определяемые в конечном итоге с помощью пошаговых процедур. По методу Холма отмечаем 0,3326 < 0,4096. Потому что метод требует, чтобы P A 2 P A 3 , мы устанавливаем P A 2 = 0,4096, а не начальное значение потенциала 0,3326. Аналогично, при условии p a 1 p a 2 , положим p a 1 1 .4096, в результате чего значения Holm p составляют 0,4096, 0,4096, 0,4096 и 0,0470. Согласно методу Хохберга, мы снова отмечаем, что 0,3326 < 0,4096 и что требование p a 2 p a 3 существует. В соответствии с методом Хохберга мы установили p a 3 = 0,3326, а не начальное потенциальное значение 0,4096, в результате чего значения Хохберга p равны 0,3587, 0,3326, 0,3326 и 0,0470.

Метод Hommel (1988) требует расчета значений Simes (1986) p для подмножеств гипотез для каждого скорректированного значения p . Например, p a 3 требует вычисления значений Simes p для следующих четырех подмножеств гипотез: {H 01 , H 02 , H 03 , 1 {H 01 , H 02 , H 03 }, {H 01 , H 03 } и {H 03 }.Значения Simes p для этих подмножеств составляют 0,0470, 0,2495, 0,2731 и 0,1365 соответственно, где p a 3 — максимальное из этих значений, 0,2731. Значения Hommel p составляют 0,3587, 0,3326, 0,2731 и 0,0470 соответственно.

Методы класса Сидака имеют одинаковую общую форму: Используя г ( j ) = M = 4, значения Sidak p равны 0.8309, 0,5169, 0,4441 и 0,0462 соответственно для четырех подмножеств гипотез. Используя г ( j ) = √ M = 2, значения TCH p составляют 0,5887, 0,3050, 0,2544 и 0,0234 соответственно. Для методов D/AP и RSA требуется корреляционная информация. Предположим, что значения mean.ρ( j ), средней корреляции для j -го исхода со всеми остальными исходами, составляют 0,3558, 0,3915, 0,3546 и 0,3841 для исходов V(1)–V(4) соответственно. . Используя формулу D/AP, скорректированные значения p равны 0.6622, 0,3448, 0,3017 и 0,0274 соответственно. Аналогично, при значениях R 2( j ) 0,2077, 0,2744, 0,2271 и 0,2618 значения RSA p равны 0,7362, 0,3919, 0,3486 и 0,0323 соответственно.

Методы класса передискретизации полагаются на эмпирические нулевые распределения minP. Мы сгенерировали дистрибутивы на основе N boot = 100 000 ресемплов. По методу minP p aj представляет собой вероятность наблюдения значения X p j , где X соответствует эмпирическому нулевому распределению minP, полученному с использованием всех четырех исходов.В графическом представлении это соответствует площади под графиком эмпирического распределения слева от значения p j . Значения minP p , основанные на нашем сгенерированном распределении, составляют 0,7980, 0,4748, 0,4055 и 0,0434. По методу sd.minP мы сравниваем только p 4 , наименьшее значение p , с этим распределением. Напомним, что каждое p j сравнивается с распределением, полученным при использовании только результатов B (1)– B ( j ).Так, p a 3 вычисляется с использованием распределения, основанного только на B (1)– B (3) и т.д. На основе этих распределений потенциальное значение для каждого p aj представляет собой площадь слева от p j и ниже соответствующей кривой распределения. Эти потенциальные значения составляют 0,3616, 0,2925, 0,3328 и 0,0434. Подобно методу Холма (1979), мы отмечаем 0,2925 < 0,3328 и, таким образом, увеличиваем p a 2 до значения p a 3 , что приводит к sd.minP p значения 0,3616, 0,3328, 0,3328 и 0,0434. Мы предоставляем графическое представление на рисунке S1 дополнительных материалов.

Анализ чувствительности

Данные

Мы использовали набор данных из исследования нейропсихологических показателей, проведенного в Университете Питтсбурга в Передовом центре исследований вмешательств и услуг для расстройств настроения в пожилом возрасте, Западном психиатрическом институте и клинике в Питтсбурге, Пенсильвания (Баттерс). и др., 2004). В исследовании использовалась группа из 140 участников (100 участников с депрессией и 40 участников сравнения без депрессии) в возрасте 60 лет и старше, группы были сопоставимы по возрасту и образованию.Мы провели анализ чувствительности в отношении 17 взаимосвязанных нейропсихологических тестов (т. е. показателей результатов) из этого набора данных, при этом тесты подробно описаны и процитированы в Butters et al. Эти показатели результатов были сгруппированы в пять теоретических областей. Матрица корреляции результатов показана на рис.

Таблица 2

Таблица 2

нейропсихологический исход корреляции матрицы

ID и результат 1.1 1.2 1.3 2,1 2.2 2.3 3.1 3.1 3.2 3.3 3.4 4,4 4,2 4,2 4 9 5.1 5.2 5.3 5.4
1.1. Рифленый Pegboard
1.2. Digit Symbol .61
1,3. Трассы Making Test-A (A) Трассы 0,63 0,62
2.1. Блок-дизайн 0,48 0,53 0,43
2.2 . Простые рисунки +0,55 0,46 0,41 0,54
2 .3. Часы рисунок +0,40 +0,38 0,39 0,49 0,51
3.1. Трейли, делающие Test-B (Trails B) .62 .61 .69 .49 .49 .49 .40 .
3.2. Тест сортировки карты Висконсин .43 .48 .40 .47 .47 .42 .44 .44
3.3. Исполнительный Интервью 0,47 0,42 0,36 0,48 +0,35 +0,23 +0,40 +0,36
3.4. Stroop .60 . 60847 .40 .50 .32 .32 .32 .32 .60 .36 .23
4.1. California словесный тест на обучение .42 .49 .49 .39 .39 .38 .38 .38 .40 .38 .43 .43 .43 4.2. Модифицированные Рей-Остереэте Рисунок .47 .32 .49 .49 .49 .38 .25 .37 .22 .35 .29 .38
4.3. Логическая память .28 .33 .24 .38 .34 .22 .22 .32 .33 .33 .09 .41 .41 .44
5.1. Тест Бостона имен .54 .40 .40 .36 .38 .48 .48 .36 .36 .33 .38 .34 .34 . 47 .33
5.2. Бедствование животных .38 .48 .27 .27 .36 .33 .22 .39 .25 .27 .11 .35 .35 .35 .35 .35 .38 .37 .46
5.3. Свободное письмо .34 .47 .30 .22 .35 .22 .37 .24 .44 .49 .36 .23 .27 .27 .41 .50
5.4. Spot-Word .06 .17 .09 .24 .24 .28 .14 .12 .09 .23 .08 0,0847 .17 .19 .40 .16 .31

Анализ

Мы сравнили анализ чувствительности, чтобы сравнить 10 методов корректировки, описанных в разделе p — Методы корректировки значений, в отношении закономерностей отклонения гипотезы и вывода. Мы провели тесты t с двумя выборками, чтобы проверить нулевую гипотезу об отсутствии различий между депрессивными группами и группами сравнения для каждого из 17 показателей исхода. Методы корректировки значений p применялись с использованием процедуры мультитеста, доступной в программном обеспечении SAS/STAT (SAS Institute Inc., 2002–2006 гг.). Эта процедура позволила вычислить скорректированные значения p для методов класса Бонферрони и передискретизации, а также для метода Сидака. Для методов передискретизации мы использовали в расчетах 100 000 бутстреп-выборок. Производные Sidak (TCH, D/AP и RSA) были запрограммированы в макросе SAS (доступен по запросу).

Результаты

сравнивает скорректированные значения p для каждого метода по всем результатам. В легенде указано общее количество отклоненных гипотез для каждого метода.Мы использовали масштаб квадратного корня для оси y , чтобы уменьшить количество перекрывающихся точек. Скорректированные значения p , основанные на меньших нескорректированных значениях p , прежде всего в областях скорости обработки информации и зрительно-пространственных способностей, по-прежнему трудно различить; числовые значения показаны в Таблице S1 в дополнительных материалах. Среди методов класса Бонферрони метод Бонферрони имел самые большие значения p и, таким образом, был наиболее консервативным из методов, за ним следуют методы Холма (1979), Хохберга (1988) и Хоммела (1988), которые были наименее консервативный.Метод Сидака дал результаты, аналогичные методу Бонферрони. Производные Сидака были более либеральными, все они давали результаты, аналогичные методам Хохберга и Хоммеля; D/AP был самым консервативным из трех. Как правило, TCH был наименее консервативным, хотя RSA давал несколько меньшие значения p , в основном, когда наблюдаемое значение p также было довольно небольшим.

Скорректированные значения p методом по нейропсихологическим исходам. Имеется 17 наблюдаемых p значений для набора из 17 нейропсихологических показателей и скорректированных p значений по каждому методу.Шкала квадратного корня используется для уменьшения перекрывающихся точек. Цифры в круглых скобках в легенде означают количество отвергнутых гипотез для данного метода. Символы результатов с отклонением нулевой гипотезы без корректировки означают следующее: + = нулевая гипотеза отклонена с использованием каждого метода корректировки; x = нулевая гипотеза не отвергнута никаким методом корректировки; o = нулевая гипотеза отклонена некоторыми методами корректировки. Полноцветная версия этой фигуры включена в дополнительные онлайн-материалы.

Методы повторной выборки дали относительно консервативные результаты с общими выводами, аналогичными методам Бонферрони и Сидака. Метод sd.minP отклонил нулевую гипотезу для теста рисования часов, которая не была отклонена методами Бонферрони или Сидака. В то время как отношения порядка скорректированных значений p классов Бонферрони и Сидака были в высокой степени согласованными, это не соблюдалось для методов класса повторной выборки. Скорректированные значения класса повторной выборки p были меньше, чем аналог Хоммеля для некоторых результатов, и больше, чем аналог Бонферрони, для других.По сравнению друг с другом значения sd.minP p были меньше, чем значения minP p .

Эти результаты подчеркивают важность множественной проверки гипотез. Из 17 исходов и соответствующих нулевых гипотез мы отклонили 14 нулевых гипотез без корректировки. Из этих 14 только 6 нулевых гипотез были отклонены с использованием каждого метода корректировки значений p . Нулевые гипотезы относительно беглости животных и Струпа не были отвергнуты никаким методом.Таким образом, из 14 нулевых гипотез, отвергнутых без корректировки, можно с уверенностью сказать, что 2 решения по гипотезе были ошибками I рода, 6 нулевых гипотез были отклонены правильно, а 6 решений по гипотезе остались неясными. Не зная истинных различий (или их отсутствия) между популяциями в отношении этих семи результатов, мы обретаем уверенность в наших критериях отклонения гипотезы, оценивая ошибку типа I и мощность методов корректировки значений p .

Исследование методом моделирования

Метод

Целью исследования моделирования, проведенного с использованием статистического пакета R (R Development Core Team, 2006 г.), была оценка эффективности метода корректировки в двух сериях испытаний.Производительность включала как защиту от ошибок типа I, так и способность обнаруживать истинные эффекты. Мы определили каждое испытание комбинацией набора гипотез и условий корреляционной структуры, определенных ниже и обобщенных в . В данном испытании мы создали 10 000 случайных наборов данных, называемых повторами , с двумя группами размером N = 100 наблюдений в каждой. Мы решили сгенерировать M = 4 переменные исхода, обозначенные от V1 до V4, чтобы представить среднюю нейропсихологическую область. Результаты были получены в соответствии с многомерным нормальным распределением с использованием функции mvrnorm (Venables & Ripley, 2002).Ошибки типа I и оценки мощности рассчитывали с использованием скорректированных значений p для конкретного метода, основанных на двухвыборочном, равнодисперсном, двустороннем тесте t значений p из каждой повторности. Количество наборов данных с повторной выборкой, N boot , нетривиально влияет на время вычислений, но оказывает меньшее влияние на точность оценки производительности по сравнению с количеством повторений (Westfall & Young, 1993). Ставим N boot = 500 для эффективности.

Таблица 3

Параметры серии Symmetry


9

V1 V2 V3 V4
V4
TN TN TN TN TN TN TN FN FN FN FN FN
Split (Сплитформа) TN TN FN FN

Корреляция структура

Корреляция структура V1 V2 V3 В4
V1 1 ρ ρ ρ
    V2 ρ 1 ρ ρ
V3 ρ ρ 1 ρ
В4 ρ ρ ρ 1

Мы определили true null (TN) в качестве смоделированного результата без различий между группами.Нулевая гипотеза на самом деле верна, и значение p для проверки гипотезы должно быть незначимым. Истинные нулевые результаты моделировались с величиной эффекта 0,0 между двумя группами и использовались для оценки ошибки типа I. Мы определили ложный нуль (FN) как смоделированный результат со значительной разницей между группами или, альтернативно, нулевая гипотеза ложна. Ложные нулевые результаты моделировались с величиной эффекта 0,5 между группами и использовались для оценки мощности.Различные комбинации TN и FN, называемые наборами гипотез , определяли результаты V1–V4. Единые наборы гипотез определили, что все четыре результата относятся к одному типу, либо все истинные нули, либо все ложные нули, допуская только ошибку типа I или оценку мощности соответственно. Набор разделенных гипотез определил два результата как TN, а два других как FN и позволяет оценить как ошибку типа I, так и оценку мощности с использованием соответствующих смоделированных результатов. Эти наборы гипотез определяли истинность в данном испытании, позволяя проводить абсолютное сравнение методов корректировки значений p с истиной, а не только относительное сравнение, обеспечиваемое анализом чувствительности.

Для всех испытаний мы определили порог значимости для всех p значений при α = 0,05. Мы использовали несколько показателей эффективности, подробно описанных Дудойтом, Шаффером и Болдриком (2003) с адаптированной номенклатурой. Используя результаты TN, мы определили ошибку типа I как частоту ошибок для всей семьи, что означает вероятность отклонения хотя бы одной гипотезы TN. Мы определили минимальную мощность как вероятность отказа хотя бы от одного FN. Мы определили максимальную мощность как вероятность отклонения всех БС.Эти показатели эффективности были рассчитаны как доля повторений, удовлетворяющих соответствующим условиям. Мы определили среднюю мощность как среднюю вероятность отклонения БС по исходам. Этот показатель был рассчитан как средняя доля отклоненных FN по исходам.

Чтобы изучить влияние корреляции между результатами на эффективность метода корректировки значений p , мы систематически меняли уровни корреляции в двух сериях моделирования. В первой серии моделирования, серии составной симметрии (CS), использовалась корреляционная структура CS, в которой все результаты были равнокоррелированы друг с другом.Мы варьировали параметр корреляции ρ от 0,0 до 0,9 с интервалом 0,1 для 10 возможных значений. С тремя указанными наборами гипотез (единообразные-верные, однородные-ложные и разделенные) и 10 структурами CS было проведено 30 испытаний в этой серии, суммированные в .

Вторая серия моделирования, блочная симметрия (BS), определила результаты V1–V2 и V3–V4 как составляющие блоки 1 и 2. Результаты были равнокоррелированы внутри и между блоками, но с разными уровнями. Параметры внутри- и межблочной корреляции W и B варьировались между значениями 0.0, 0,2, 0,5 и 0,8 (нет, низкая, умеренная и высокая корреляция), где корреляция внутри блока строго больше, чем корреляция между блоками, то есть W > B . Корреляционная структура данных анализа чувствительности указывала на более высокую величину корреляции между исходами внутри блока (области), чем между исходами из разных блоков. Структура корреляции BS допускает изменение этих величин в более простой, двухблочной конфигурации с четырьмя исходами.Кроме того, использовался набор гипотез разделения-разделения, который определял сочетание типов результатов в целом и внутри блоков. Это отличалось от разделенного или разделенно-однородного набора гипотез, в котором подмножества гипотез, специфичных для блоков, были однородными. С четырьмя наборами гипотез и шестью корреляционными структурами в этой серии было проведено 24 испытания. Таблица S2 в дополнительных материалах суммирует параметры серии BS.

Эти структуры представляют модели корреляции, наблюдаемые между результатами внутри и между несколькими областями в данных анализа чувствительности.Структура CS актуальна для исследований, которые сосредоточены на одной области, например, на зрительно-пространственных способностях, с несколькими результатами, например, на блочное проектирование, простые рисунки и рисунок часов. Хотя структура BS менее интуитивно понятна по сравнению со структурой CS, она актуальна для исследований с несколькими доменами, например, зрительно-пространственными способностями и памятью. Хотя корреляционные структуры реальных данных более сложны, эти структуры обеспечили уместную и удобную основу для оценки методов корректировки стоимости p .

Результаты

Для краткости приведем результаты моделирования для серии CS полностью. Результаты серии BS продемонстрировали аналогичные закономерности, поэтому мы приводим результаты производительности серии BS на рисунках S2, S3 и S4 в дополнительных материалах. Мы также отмечаем, что основной целью методов корректировки значений p является контроль ошибки типа I, то есть они поддерживают ошибку типа I вблизи или ниже α = 0,05. При просмотре графиков мощности также обратите внимание на ошибку типа I, поскольку методы с большей мощностью, чем другие, но с недостаточным контролем ошибок типа I, не достигают основной цели и делают их субоптимальными.

CS–однородный набор гипотез

В , мы показываем эффективность корреляционных структур CS для методов корректировки значений p при однородных наборах гипотез (четыре TN для ошибки типа I, четыре FN для мощности). Показатели ошибки типа I показаны на верхней левой панели. Методы класса повторной выборки продемонстрировали стабильную ошибку типа I около α = 0,05 по мере увеличения корреляции CS ρ. Методы класса Бонферрони продемонстрировали тенденцию к уменьшению ошибки типа I с увеличением корреляции между результатами.Методы Bonferroni и Holm (1979) показали наименьшую ошибку типа I, тогда как методы Hochberg (1988) и Hommel (1988) допускали большую ошибку, но оставались консервативными, когда ρ превышал 0,5. Метод Сидака показал незначительно более высокую ошибку I рода, чем метод Бонферрони. Метод TCH следовал убывающей, но повышающейся тенденции; в случае независимости он продемонстрировал высокую ошибку типа I со значениями, почти вдвое превышающими пороговое значение α = 0,05. Однако в случае высокой корреляции, ρ = 0,9, это был единственный метод, который разумно приблизился к α = .05. Методы D/AP и RSA следовали либеральным немонотонным тенденциям. Эти методы показали увеличение ошибки типа I примерно до ρ = 0,6–0,7, после чего тенденции уменьшились.

p Производительность метода корректировки значений по структурам корреляции составной симметрии, ошибкам типа I и оценкам мощности для однородного набора гипотез. На верхней левой панели показаны частоты ошибок типа I для методов корректировки значений p при возрастающих значениях параметра корреляции составной симметрии ρ.В этом случае все M = 4 гипотезы моделируются как истинные. Оптимальными являются значения вблизи α = 0,05. Значения значительно выше α = 0,05 указывают на неспособность защитить от ошибки типа I при α. На остальных панелях показаны различные меры мощности, где четыре гипотезы моделируются как ложные. Оптимальна более высокая мощность при условии, что ошибка рода I не превышает α. Полноцветная версия этой фигуры включена в дополнительные онлайн-материалы.

Для средней мощности, показанной на нижней левой панели, все методы продемонстрировали приемлемые показатели выше 0.8. Методы Бонферрони и Сидака показали низкую стабильную мощность около 0,85. Ступенчатые производные Бонферрони показали высокую мощность, которая медленно уменьшалась с ростом корреляции. Метод Hommel (1988) был немного более мощным, чем метод Hochberg (1988), который был более мощным, чем метод Holm (1979). Метод TCH показал достаточно стабильную мощность около 0,9. Методы D/AP и RSA увеличивали среднюю мощность по мере увеличения ρ и при высокой корреляции были более мощными, чем производные Бонферрони.Однако, как отмечалось ранее, мощность для производных Сидака не имеет значения, учитывая, что частота ошибок типа I значительно превышает α = 0,05. Метод minP показал тенденцию к увеличению средней мощности с увеличением корреляции. Метод sd.minP продемонстрировал увеличение мощности, связанное с пошаговым подходом.

Для минимальной мощности, показанной на верхней правой панели, все методы смогли обнаружить разницу между группами по крайней мере для одного из четырех результатов по всем корреляциям с мощностью выше 0.9. Первоначальные методы Бонферрони и Сидака имели наименьшую мощность, за ними следуют производные Бонферрони, методы класса передискретизации и, наконец, производные Сидака.

Для максимальной мощности, показанной на нижнем правом графике, все методы продемонстрировали меньшую мощность по сравнению с минимальной и средней мощностью и продемонстрировали тенденции монотонного увеличения с более высокой корреляцией с различной скоростью изменения. Методы Бонферрони и Сидака снова продемонстрировали наименьшую мощность. Производные Бонферрони и sd.minP в целом работал хорошо, в диапазоне чуть ниже 0,8 для низкой корреляции и приближаясь к 0,9 для высокой корреляции. Как и прежде, метод Холма (1979) был менее мощным, чем метод Хохберга (1988), который был эквивалентен методу Хоммеля (1979), с промежуточным методом sd.minP. Опять же, метод TCH следовал модели Сидака в возвышенной манере. Методы D/AP и RSA продемонстрировали крутую скорость увеличения с увеличением корреляции, с уровнями мощности, близкими к Сидаку, с низкой корреляцией и мощностью, аналогичной производным Бонферрони и sd.метод minP при высокой корреляции.

Набор гипотез разделения CS

показывает результаты для набора гипотез разделения по структурам корреляции CS. Аналогичные отношения были обнаружены по сравнению с единым набором гипотез, хотя общие величины уменьшились для всех методов. Следует отметить относительное отсутствие уменьшения, наблюдаемое среди пошаговых методов, производных Бонферрони и методов sd.minP. Частота ошибок типа I других методов во многих случаях была почти вдвое меньше.Методы D/AP и RSA превысили α = 0,05 для высоких значений ρ.

p Производительность метода корректировки значений в структурах корреляции составной симметрии, ошибка типа I и оценки мощности для набора разделенных гипотез. Верхний левый график показывает коэффициенты ошибок Типа I методов корректировки значений p при возрастающих значениях параметра корреляции CS ρ. В этом случае все только две из M = 4 гипотез моделируются как истинные. Значения вблизи α = .05 оптимальны. Значения значительно выше α = 0,05 указывают на неспособность защитить от ошибки типа I при α. На остальных панелях показаны различные меры мощности с использованием двух гипотез, смоделированных как ложные. Оптимальна более высокая мощность при условии, что ошибка рода I не превышает α. Полноцветная версия этой фигуры включена в дополнительные онлайн-материалы.

По сравнению с оценками мощности набора однородных гипотез производные Бонферрони продемонстрировали более низкую среднюю мощность, в то время как другие методы работали аналогично.Метод sd.minP также показал снижение средней мощности, хотя и увеличилось с корреляцией. При минимальной мощности все методы продемонстрировали небольшое снижение мощности, хотя и менее выраженное для производных Сидака. С точки зрения максимальной мощности результаты для производных Бонферрони были аналогичны аналогам с единым набором гипотез, и все другие методы показали большую мощность. Методы Бонферрони и Сидака продолжали оставаться наиболее консервативными, но производные Сидака демонстрировали более высокую мощность, чем все другие методы, для корреляции CS ρ > 0.3.

Обсуждение

Результаты моделирования показали, что методы Бонферрони и Сидака, хотя и защищают от ошибок типа I, становятся все более консервативными с высокой корреляцией между результатами и имеют недостаточную мощность, особенно в отношении максимальной мощности. Производные Бонферрони, хотя и не улучшают проблему ошибки типа I, заметно улучшают среднюю и максимальную мощность. Одноступенчатые производные Сидака не проявляли мощности, аналогичной ступенчатым методам. Средняя мощность методов D/AP и RSA увеличивалась с ростом корреляции.Однако эти методы не обеспечивали приемлемой ошибки типа I. Методы класса повторной выборки продемонстрировали постоянную ошибку типа I для исследованных структур и уровней корреляции. Метод sd.minP снова продемонстрировал преимущество пошагового подхода с мощностью, аналогичной производным Бонферрони. Среди исследованных методов методы Hochberg (1988), Hommel (1979) и sd.minP продемонстрировали наилучшие характеристики, обладая значительной мощностью и приемлемой защитой от ошибок первого рода. При более высокой корреляции результатов sd.Метод minP продемонстрировал более высокую мощность, особенно в экспериментах с разделенной гипотезой. Таким образом, для более низкой корреляции между нейропсихологическими исходами, то есть среднего ρ < 0,5, мы рекомендуем либо методы Хохберга, либо методы Хоммеля по причинам простоты реализации и точной воспроизводимости. Для более высокой корреляции между нейропсихологическими результатами мы рекомендуем метод sd.minP для увеличения мощности.

Тем не менее, мы должны сделать оговорку к этому простому правилу. С внедрением процедуры мультитестирования SAS/STAT (SAS Institute Inc., 2002–2006), предположение о равной дисперсии было единственным вариантом для тестовой статистики, используемой с методами minP и sd.minP. Когда предположение о равной дисперсии нарушается, использование тестов равной дисперсии t может привести к неточным наблюдаемым значениям p и неточным эмпирическим нулевым распределениям minP, что приведет к консервативным результатам, показанным в нашем анализе чувствительности.

В идеале можно было бы использовать метод sd.minP без допущения одинаковой дисперсии для всех результатов, хотя, насколько нам известно, современные статистические пакеты программного обеспечения не поддерживают эту функцию.В то время как параметрические методы представляют собой простые формулы, дающие одинаковые результаты для разных пакетов, методы класса повторной выборки могут различаться по своей реализации от пакета к пакету, особенно в отношении типа тестов, которые могут проводиться. Если тесты на равенство дисперсий отклоняются для многих результатов, текущие программные реализации могут давать меньшую мощность. В этом случае для среднего ρ ≥ 0,5 мы предпочитаем методы Hochberg (1988) и Hommel (1979). Для нейропсихологических данных, изучаемых в анализе чувствительности, с высокой корреляцией между исходами и многими исходами с неравной дисперсией между группами наиболее подходящими являются методы Хохберга и Хоммеля.

Другим важным предостережением в отношении методов класса повторной выборки является количество N загрузочных выборок, используемых для создания эмпирически полученных распределений нулевых минимумов p значений. Westfall и Young (1993) рекомендовали не менее 10 000. На практике этого может быть недостаточно. Невозможно оценить небольшие значения p с разумной степенью точности без достаточного количества выборок для оценки хвостов распределения. При слишком малом количестве повторных выборок повторное применение этих методов может привести к другим выводам.Хотя мы использовали 100 000 для нашего анализа чувствительности, по общему признанию, наименьшее нескорректированное значение p нельзя было точно оценить с помощью 100 000, хотя скорректированный аналог все еще был значительно ниже α = 0,05.

Методы D/AP и RSA, разработанные для включения корреляции в уравнивание, оказались недостаточными для защиты от ошибок типа I. Средняя мощность этих методов была адекватной, но максимальная мощность была слабой из-за низкой корреляции между исходами. Дальнейшие исследования в этой области могут выявить другую функцию, которая преодолевает эти недостатки.

В этом расследовании можно было бы рассмотреть и другие методы. Dunnett и Tamhane (1992) и Rom (1990) разработали пошаговые процедуры с мотивацией снижения ошибки типа II. Оба метода делают сильные предположения о распределении и требуют сложных итерационных вычислений. Кроме того, ни один из методов не был реализован ни в одном статистическом программном обеспечении. Методы класса повторной выборки также включают методы перестановки, которые дают результаты, аналогичные методам начальной загрузки, когда оба метода могут быть легко применены, но чрезвычайно сложны для применения во многих аналитических ситуациях (Westfall & Young, 1993).Таким образом, мы исключили эти методы из рассмотрения.

Мы решили смоделировать только четыре результата, чтобы получить представление о производительности этих методов. Вполне вероятно, что тенденции просто станут более выраженными и преувеличенными при большем количестве результатов, хотя это может быть подтверждено другим обширным исследованием моделирования.

Анализ чувствительности и имитационное исследование были проведены в SAS и R, поскольку многие используемые методы были встроены в программное обеспечение, а остальные методы можно было запрограммировать относительно легко.SPSS и Stata, программное обеспечение, предпочитаемое некоторыми исследователями, имеют ограниченный набор методов, доступных для анализа сравнений дисперсионного типа, и ни одного для множественных тестов с двумя выборками, как показано в этом исследовании (SPSS Inc., 2006; Stata Press, 2007). ). Метод Hochberg (1988) можно было относительно легко запрограммировать в любом пакете; на самом деле, это можно было бы запрограммировать в программном обеспечении для работы с электронными таблицами. Однако методы Hommel (1979) и sd.minP были бы более сложными. Перепрограммирование этих методов для SPSS или Stata, вероятно, будет менее эффективным, чем изучение сравнительно небольшого числа команд, необходимых для проведения корректировки значений p в SAS или R.

В настоящее время не существует идеального метода корректировки для проверки множественных гипотез с нейропсихологическими данными. Методы sd.minP, Hochberg (1988) и Hommel (1979) продемонстрировали защиту от ошибок типа I с хорошей мощностью, хотя новые исследования могут дать методы, превосходящие их по эффективности.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Национального института психического здоровья T32 MH073451, P30 MH071944 и R01 MH072947 и грантом Национального института проблем старения P01 AG020677.Мы благодарим Саната Саркара из Университета Темпл за его вклад в эту статью.

Информация для участников

Ричард Э. Блейксли, кафедра биостатистики, Университет Питтсбурга.

Сати Мазумдар, кафедра биостатистики Питтсбургского университета и кафедра психиатрии Медицинской школы Питтсбургского университета.

Мэри Аманда Дью, факультет психиатрии Медицинской школы Университета Питтсбурга и факультеты эпидемиологии и психологии Университета Питтсбурга.

Патрисия Р. Хоук, факультет психиатрии, Медицинская школа Университета Питтсбурга.

Гонг Танг, кафедра биостатистики, Университет Питтсбурга.

Чарльз Ф. Рейнольдс, III, кафедра психиатрии, Медицинская школа Университета Питтсбурга.

Мерил А. Баттерс, факультет психиатрии, Медицинская школа Университета Питтсбурга.

Ссылки

  • Баттерс М.А., Уайт Э.М., Небес Р.Д., Бегли А.Е., Дью М.А., Мулсант Б.Х. и др.Природа и детерминанты нейропсихологического функционирования при депрессии позднего возраста. Архив общей психиатрии. 2004; 61: 587–595. [PubMed] [Google Scholar]
  • Dudoit S, Shaffer JP, Boldrick JC. Множественная проверка гипотез в экспериментах с микрочипами. Статистическая наука. 2003; 18:71–103. [Google Scholar]
  • Dunnett CW, Tamhane AC. Пошаговая процедура многократного тестирования. Журнал Американской статистической ассоциации. 1992; 87: 162–170. [Google Scholar]
  • Хохберг Ю. Более точная процедура Бонферрони для множественных критериев значимости.Биометрика. 1988; 75: 800–802. [Google Scholar]
  • Hochberg Y, Benjamini Y. Более мощные процедуры проверки множественной значимости. Статистика в медицине. 1990; 9: 811–818. [PubMed] [Google Scholar]
  • Холм С. Простая процедура последовательного отбраковывания нескольких тестов. Скандинавский статистический журнал. 1979; 6: 65–70. [Google Scholar]
  • Hommel G. Процедура поэтапного множественного отбраковочного теста, основанная на модифицированном тесте Бонферрони. Биометрика. 1988; 75: 383–386. [Google Scholar]
  • Хоммель Г.Сравнение двух модифицированных процедур Бонферрони. Биометрика. 1989; 76: 624–625. [Google Scholar]
  • Pocock SJ. Клинические испытания с множественными исходами: статистический взгляд на их дизайн, анализ и интерпретацию. Контролируемые клинические испытания. 1997; 18: 530–545. [PubMed] [Google Scholar]
  • R Основная команда разработчиков. Вена: R Foundation for Statistical Computing; 2006. R: Язык и среда для статистических вычислений. Доступно на http://www.R-project.org. [Google Scholar]
  • Ром DM.Процедура последовательного отбраковывания, основанная на модифицированном неравенстве Бонферрони. Биометрика. 1990; 77: 663–665. [Google Scholar]
  • Салтелли А., Чан К., Скотт Э.М., редакторы. Анализ чувствительности: оценка ценности научных моделей. Нью-Йорк: Уайли; 2000. [Google Scholar]
  • Санкох А.Дж., Д’Агостино Р.Б., Хуке М.Ф. Методы выбора конечной точки эффективности и корректировки множественности в клинических испытаниях с неотъемлемыми проблемами с множественными конечными точками. Статистика в медицине. 2003; 22:3133–3150. [PubMed] [Google Scholar]
  • Sankoh AJ, Huque MF, Dubey SD.Некоторые комментарии о часто используемых методах корректировки множественных конечных точек в клинических испытаниях. Статистика в медицине. 1997; 16: 2529–2542. [PubMed] [Google Scholar]
  • SAS Institute Inc. SA S OnlineDoc 9.1.3. Кэри, Северная Каролина: Автор; 2002–2006 гг. [Google Scholar]
  • Сидак З. Прямоугольные доверительные области для средних многомерных нормальных распределений. Журнал Американской статистической ассоциации. 1967; 62: 626–633. [Google Scholar]
  • Саймс Р.Дж. Усовершенствованная процедура Бонферрони для множественных критериев значимости.Биометрика. 1986; 73: 751–754. [Google Scholar]
  • SPSS Inc. Руководство пользователя SPSS base 1 5.0. Чикаго: Автор; 2006. [Google Scholar]
  • Stata Press. Комплект базовой документации Stata 10. Колледж-Стейшн, Техас: Автор; 2007. [Google Scholar]
  • Venables WN, Ripley BD. Современная прикладная статистика с С. 4-е изд. Нью-Йорк: Спрингер; 2002. [Google Scholar]
  • Вербеке Г., Моленбергс Г. Линейные смешанные модели для продольных данных. Нью-Йорк: Спрингер; 2001. [Google Scholar]
  • Westfall PH, Young SS.Множественное тестирование на основе повторной выборки: примеры и методы корректировки p-значения. Нью-Йорк: Уайли; 1993. [Google Scholar]
  • Райт С.П. Скорректированные P-значения для одновременного вывода. Биометрия. 1992;48:1005–1013. [Google Scholar]

Фасады Эрика Лундгрена

Я думаю, что 2,5 является более точным для меня. В нем определенно есть несколько действительно умных элементов, но они кажутся потраченными впустую на слабую, одноразовую историю.

В книге есть момент, когда главный герой Свен читает мемуары самого влиятельного архитектора города Труде, сумасшедшего, но гениального Клауса Бернхарда.Бернхард называет свою потерянную любовь Улли «пропавшим сердцем» своей архитектуры. По иронии судьбы, Фасады , похоже, понесли аналогичную потерю.

В такой стильной и хипстерской книге, как эта,

Я думаю, что 2,5 будет более точным для меня. В нем определенно есть несколько действительно умных элементов, но они кажутся потраченными впустую на слабую, одноразовую историю.

В книге есть момент, когда главный герой Свен читает мемуары самого влиятельного архитектора города Труде, сумасшедшего, но гениального Клауса Бернхарда.Бернхард называет свою потерянную любовь Улли «пропавшим сердцем» своей архитектуры. По иронии судьбы, Фасады , похоже, понесли аналогичную потерю.

В такой стильной и хипстерской книге, как эта, я не могу сказать, что удивлен тем, что в ней «отсутствует сердце». Всякий раз, когда книга имеет очевидную озабоченность, например эстетику, другие элементы повествования, кажется, отходят на второй план. В конечном счете, я бы хотел, чтобы главные герои и сюжет соответствовали обстановке. Свен (да, мы получаем сокровенные мысли человека, которого на самом деле зовут Свен, живущего в Муррике) — стереотипный пригородный мокрый плед, а его сын Кайл — замкнутый и одинокий.Свен — параноик, который каждую ночь отправляется на поиски своей пропавшей жены Молли. Кайл без особой помпы становится искренне религиозным и впоследствии на протяжении большей части книги представляет собой просто призрачное присутствие. Ни один из персонажей не вызывает особого интереса. Молли кажется, что ей есть что рассказать, но мы слышим голос Свена, сухое, механическое повествование, которому не хватает интимности и эмоциональной твердости.

Трюд — реальный персонаж в The Facades . Эрик Лундгрен, кажется, добился успеха, описывая историю города и вечно недовольного архитектора, который внес свой вклад в его печально известный дизайн.Возьмем, к примеру, торговый центр Trude’s: Построен в виде спирали с, казалось бы, неразрешимым, таинственным лабиринтом высоких живых изгородей в центре…

«Торговый центр стал самой популярной туристической достопримечательностью Trude, несмотря на то, что он был непригоден для настоящих покупок: люди прибывали со всего мира, чтобы просто пройтись по нему, выезжая из города, даже не ступая в центр. Возможно, предельная пустота в сердцевине капитализма была дидактической шуткой архитектора. Они продавали сувенирную футболку на прилавке за пределами лабиринта, на которой была напечатана схема спирали Бернхарда и лозунг «ТРУД, МЫ ПЫТАЛИСЬ».”

Торговый центр действительно захватил мое воображение. То же самое произошло и с чрезвычайно избирательным домом престарелых Traumhaus, обитатели которого зарабатывают себе на жизнь тем, что пишут мемуары — чем тревожнее, тем лучше — и отправляют главы на рецензию. Так что отрывки, посвященные «Труде» и ее странностям, были мерцающими моментами творчества, которые убедили меня в потенциале Лундгрена как писателя-фантаста. Я бы прочитал еще одну книгу, действие которой происходит в Труде, если он решит развивать эту маленькую вселенную, которую он создал, в надежде, что вторая часть, вращающаяся вокруг всех новых персонажей, может улучшить повествовательные заминки первой.

Возможно, это было очевидно из описания книги, но я не ожидал постмодернистского подтекста, т. е. как мы можем знать, что то, что мы знаем, является правдой? там – мне постоянно вспоминались многочисленные реинкарнации символа почтового рога и сводящий с ума квест Плач Лота 49 и тот отдел в 1984 , где история буквально переписывается. Я полагаю, что это не модно опускать слово «постмодерн» в обложке, но Лундгрен, похоже, хочет поиграть с этим, с нестабильностью вещей, которые мы считаем неизменными.Я просто не думаю, что он толкает это достаточно далеко. Недостаток приверженности идеям делает их сырыми и чересчур срочными. Я понимаю, что не даю особого контекста тому, как это сочетается с постмодерном. Ничего не спойлеря, трудно сформулировать, кроме этого: параноик Свен стремится найти ответы, только сможет ли он?

Иногда изобретательная, иногда скучная, Фасады — странная маленькая книжка. Некоторым порекомендую, точно не всем.

Высвобождение малых РНК-содержащих экзосомоподобных везикул из человеческого филяриального паразита Brugia malayi

Образец цитирования: Zamanian M, Fraser LM, Agbedanu PN, Harischandra H, Moorhead AR, Day TA, et al.(2015) Высвобождение малых РНК-содержащих экзосомоподобных везикул из человеческого филяриального паразита Brugia malayi . PLoS Negl Trop Dis 9(9): e0004069. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069

Редактор: Achim Hoerauf, Институт медицинской микробиологии, иммунологии и паразитологии, ГЕРМАНИЯ

Поступила в редакцию: 10 марта 2015 г.; Принято: 18 августа 2015 г .; Опубликовано: 24 сентября 2015 г.

Copyright: © 2015 Zamanian et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и его вспомогательные информационные файлы.

Финансирование: Эта работа была поддержана премией Национального института продовольствия и сельского хозяйства 1001501 MJK. URL-адрес: www.csrees.com.usda.gov. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Паразитические филяриатозные нематоды Wuchereria bancrofti , Brugia malayi и B. timori являются этиологическими агентами лимфатического филяриатоза (LF), хронического и инвалидизирующего заболевания, поражающего более 11 000 человек. ].Взрослые паразиты обитают в лимфатических сосудах инфицированных людей и выделяют личинок, называемых микрофиляриями, которые поглощаются комарами-переносчиками во время кровососания. Паразиты быстро развиваются внутри комара, дважды линяют до инфекционной стадии L3 [2, 3] перед передачей окончательному хозяину при последующем питании кровью. После проникновения в позвоночного хозяина через укол, оставленный комаром, паразиты на стадии L3 мигрируют в лимфатические сосуды и подвергаются дальнейшему росту и развитию, линьке до стадии L4 и снова во взрослую жизнь.Продолжительность открытой инфекции замечательна; по общему мнению, взрослые живут не менее 8–10 лет. Способность личиночных стадий успешно вторгаться в хозяина, а взрослых червей поддерживать инфекцию в течение такого длительного периода времени, предполагает, что филяриальные черви разработали стратегии, которые как способствуют установлению инфекции, так и уклоняются от иммунного ответа хозяина или манипулируют им. Хотя иммуномодулирующие возможности заражения филяриатозными червями на личиночной и взрослой стадии хорошо задокументированы и рассмотрены [4–8], эффекторные молекулы паразита, ответственные за манипулирование биологией хозяина, и механизмы их высвобождения трудно определить.Активно секретируемые белки исторически считались основными кандидатами, и было идентифицировано несколько секретируемых белков с доказуемой биологической активностью на границе хозяин-паразит [9-12]. В дополнение к этому, характеристика секретомов паразитических нематод выявила сложный набор потенциальных белковых эффекторов [13-16]. Другие типы эффекторов, в том числе молекулы, экспрессируемые на поверхности паразита, могут играть роль [17], а появление малых некодирующих РНК в качестве межклеточных агентов генетической регуляции [18–22] указывает на возбуждающие альтернативные механизмы.

Экзосомы представляют собой подтип внеклеточных везикул, классифицируемых по размеру (диаметр 30–120 нм) и определяемых определенным биогенным путем [23]; экзосомы формируются путем внутреннего отпочкования везикул на позднем эндосомальном пути с образованием мультивезикулярных эндосом, которые сливаются с плазматической мембраной для осуществления высвобождения [24, 25]. Первоначально считавшиеся средством удаления клеточных отходов, экзосомы теперь считаются высокобиологически активными внеклеточными везикулами, которые облегчают межклеточную коммуникацию и находятся в центре внимания новых исследований.Груз экзосом сложен и изменчив, он содержит биологически активные белки, функциональную мРНК, микроРНК и другие виды малых некодирующих РНК [18, 26], вероятно, отражающие как исходную, так и целевую среду. Слияние экзосомы с клеткой-мишенью доставляет этот гетерогенный биоактивный груз и избирательно изменяет биологию ткани-мишени [19, 21, 26, 27]; изоляция экзосом из систем кровообращения и ряда биожидкостей предполагает, что эффекторные сайты могут находиться далеко от точки высвобождения.Известно, что паразиты выделяют экзосомоподобные везикулы [27-30], и убедительно предположить, что биологически активные молекулы, секретируемые паразитическими нематодами, упакованные в экзосомы, функционируют как межклеточные эффекторы при взаимодействии паразит-хозяин. Действительно, недавно было показано, что внеклеточные везикулы, секретируемые желудочно-кишечной нематодой
Heligmosomoides polygyrus
, содержащие белки и малые РНК, изменяют экспрессию генов в клетках-хозяевах и подавляют врожденный иммунный ответ у мышей [26].

Здесь мы показываем, что личиночная и взрослая стадии B. malayi выделяют огромное количество внеклеточных везикул in vitro , размер и морфология которых соответствуют экзосомам. Эти экзосомоподобные внеклеточные везикулы (ELV) содержат виды малых РНК, включая специфические микроРНК, и обогащены микроРНК, идентичными микроРНК хозяина с известными иммуномодулирующими ролями [31-34]. Белковый груз везикул относительно скуден, но включает биоактивные белки, белки с предполагаемыми свойствами связывания РНК и белки, обычно связанные с экзосомами [35].ELV паразита интернализуются макрофагами хозяина и вызывают в этих клетках классически активированный фенотип. Демонстрация того, что филяриальные нематоды секретируют экзосомальную РНК и белки, которые потенциально функционируют на границе хозяин-паразит, имеет большое значение. Определение этого инструментария эффекторных паразитов раскрывает множество новых молекул, которые могут быть использованы в новых стратегиях контроля LF.

Результаты и обсуждение

Инфекционная стадия

B. malayi высвобождает экзосомоподобные везикулы

Чтобы установить, высвобождаются ли экзосомы B.malayi внеклеточные везикулы выделяли из паразитов, инкубированных в культуральной среде, с использованием протокола фильтрации и ультрацентрифугирования. Мы сосредоточили наши первоначальные усилия по открытию паразитов на личиночной и взрослой стадиях. L3, взрослых самцов и взрослых самок B. malayi инкубировали in vitro в течение 24 часов в стандартных условиях культивирования, а очищенные препараты везикул оценивали с помощью электронной микроскопии (ЭМ). Паразиты инфекционной стадии L3 в культуре выделяют обильные микровезикулы размером 50–120 нм, соответствующие классической морфологии «сдутого шара» экзосом млекопитающих и немлекопитающих, описанной в литературе [36] (рис. 1A и 1B).Мы называем их экзосомоподобными везикулами (ELV) на протяжении всей этой рукописи, признавая, что они не могут быть однозначно обозначены как экзосомы, а не как другой класс внеклеточных везикул, поскольку их биогенез не был определен. Препараты взрослой стадии B. malayi были более гетерогенными и разбавленными, что не позволяло провести окончательную категоризацию предполагаемых экзосомоподобных везикул (рис. 1C). И это несмотря на то, что для препаратов взрослых особей использовалась гораздо большая масса тотальной ткани паразита, чем для препаратов личинок.Эти данные предполагают, что высвобождение ELV является преимущественно личиночным явлением у B. malayi , рабочая гипотеза подтверждается анализом РНК, связанной с везикулами. Поэтому мы решили сосредоточить наши последующие эксперименты на паразитах стадии L3. Убедительная общая гипотеза о функции B. malayi ELV заключается в том, что они опосредуют секрецию и транспортировку в клетки-хозяева эффекторных молекул, которые способствуют паразитизму, и наблюдение, что секреция ELV происходит в основном на тех стадиях паразита, которые заражают хозяина и вызывают паразитемию. соответствует этому рассказу.

Рис. 1. Электронная микроскопия подтверждает секрецию экзосомоподобных везикул на внутрихозяинных стадиях B. malayi .

Показаны ПЭМ-изображения препаратов L3 (A и B) и взрослой самки (C) ELV. Везикулы L3 приобретают отчетливую морфологию, о которой часто сообщается в литературе. Выделения взрослых являются более гетерогенными и могут потребовать дальнейшей оптимизации для достижения однородной подготовки пузырьков. Белые стрелки показывают канонические ELV L3 (B) и предполагаемые ELV для взрослых (C). Это свидетельствует о высвобождении экзосомоподобных везикул на инфекционной для человека стадии паразита L3, и большая часть оставшейся работы, о которой мы сообщаем, сосредоточена на везикулах, полученных на этой личиночной стадии.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g001

Временной профиль высвобождения экзосомоподобных везикул с инфекционной стадии

B. malayi

Чтобы более точно определить динамику высвобождения ELV в L3 B. malayi , мы использовали систему анализа отслеживания наночастиц (NTA) для измерения выхода везикул в течение 72 часов in vitro . Среду собирали у 300 червей после трех последовательных 24-часовых инкубационных периодов, везикулы очищали ультрацентрифугированием, как и раньше, и отдельные препараты везикул анализировали с помощью NanoSight LM10, как показано на рис. 2 (запись образца: видео S1).Препараты на 1-й день (0–24 часа в культуре) демонстрируют обильную скорость высвобождения ELV (> 9000 ELV/паразит/мин) с очень узким распределением по размерам с центром около 90 нм. Препараты на 2-й день (24–48 часов в культуре) демонстрируют по существу эквивалентную скорость высвобождения, но резкое расширение распределения по размерам. Препараты на 3-й день (48–72 часа в культуре) связаны со значительно более низкими уровнями высвобождения (<4000 ELV/паразит/мин) и еще более широким мультимодальным распределением по размерам. Эти данные свидетельствуют об общем зависимом от времени снижении скорости высвобождения пузырьков и специфичности размера, что коррелирует со снижением жизнеспособности L3 in vitro .Высвобождение значительных количеств ELV точного размера у жизнеспособных червей (Дни 1–2) сопровождается высвобождением меньших количеств частиц более широкого диапазона размеров, которые потенциально включают более крупные мембранные везикулы и апоптотические пузырьки (Дни 2–3). Это предполагает активный и регулируемый механизм высвобождения ELV у здоровых и жизнеспособных паразитов на стадии L3, в отличие от пассивного режима шумного разрушения клеток.

Рис. 2. Анализ отслеживания частиц показывает скорость высвобождения плодовитых личиночных Brugia экзосомоподобных везикул.

Профиль ELV, выделенных из питательных сред, инкубированных с 300 паразитами L3 в течение последовательных 24-часовых инкубаций. Показано распределение размера ELV, полученных из L3, в день 1 (слева), день 2 (в центре) и день 3 (справа) инкубации (среднее значение ± стандартное отклонение). Рассчитанные скорости высвобождения везикул представлены в табличном формате. Скорость высвобождения ELV и размерная специфичность уменьшаются в зависимости от времени in vitro . * пересчитано на основе разбавления для сравнения с разбавлением 0–24 часа (1:20).

https://дои.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g002

Белковый груз

Brugia экзосомоподобных везикул

Содержание белка в B. malayi ELV определяли с помощью наномасштабной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (нано ЖХ/МС/МС). С помощью MASCOT было идентифицировано в общей сложности 32 белка, каждый из которых содержал не менее двух уникальных пептидов (таблица 1). Конкретные белки, идентифицированные в осадке, включали характерные маркеры экзосом, включая Hsp70, фактор элонгации-1 α , фактор элонгации-2, актин и Rab-1.Кроме того, более 80% идентифицированных белков являются ортологичными белкам, идентифицированным в протеомах экзосом млекопитающих, что убедительно свидетельствует о том, что эти везикулы являются экзосомоподобными по своей природе, и поддерживает наше обозначение ELV здесь. Интересно, что этот набор специфичных для везикул белков полностью отличается от белков, ранее идентифицированных в выделениях L3 до и после линьки [37].

UniProt-GOA и quickGO использовались для сортировки белков по функциональным группам на основе назначенных терминов генной онтологии (GO) [38, 39], как показано на рис. 3.На основании аннотаций GO 20% идентифицированных белков участвуют в связывании биоактивных молекул, включая нуклеиновые кислоты и другие белки, 16% участвуют в транспорте различных ионов и белков и 14% являются рибосомными белками. Кроме того, большая часть идентифицированных белков (21%), по-видимому, участвует в различных метаболических процессах, включая гидролазную и трансферазную активность, в то время как остальные 29% включают белки с трансляционными, цитоскелетными и другими функциями.

Включенные в список белки Brugia ELV являются потенциальными эффекторными молекулами.Bm-CPL-1 представляет собой катепсин L-подобную цистеиновую протеазу, устойчиво экспрессирующуюся на протяжении жизненного цикла B. malayi [40]. Активация экспрессии Bm-cpl-1 совпадает с переходом между стадиями жизненного цикла, и была подтверждена важная роль в модуляции линьки паразита [41–43]. Это первая демонстрация того, что B. malayi секретирует CPL-1, хотя другие катепсиноподобные цистеиновые протеазы были идентифицированы в секретоме B. malayi [14, 37], а катепсин L-подобная молекула секретируется интра- стадия млекопитающих Haemonchus contortus [44].Экзогенная функция экзосомального Bm-CPL-1 не ясна, но данные указывают на некоторые манипуляции с интерфейсом хозяин-паразит. В предыдущем исследовании мы подавили экспрессию Bm-cpl-1 , используя РНКи in vivo на этапах жизни комара [42]. Потеря функции снизила распространенность инфекции у комаров почти на 40%, что позволяет предположить, что Bm-CPL-1 важен для установления или поддержания паразитемии. У плоских червей лучше установлена ​​иммуномодулирующая роль секретируемых катепсин L-подобных протеаз [45]; при инфекции Fasciola катепсин L способствует пермиссивной поляризованной реакции хозяина Th3 > Th2.

Протеомные профили экзосом паразитических гельминтов имеют широкий диапазон; например, более 350 белков были идентифицированы в предполагаемых экзосомах, секретируемых Heligmosomoides polygyrus [26], в то время как 45 и 79 белков были идентифицированы в экзосомоподобных везикулах из Echinostoma caproni и Fasciola hepatica , соответственно [46]. Идентифицированный здесь профиль стадии B. malayi L3 является относительно скудным, но согласуется с этим широким распространением.Возможно, это наблюдение, специфичное для стадии, и ELV, секретируемый другими стадиями жизни B. malayi , демонстрирует более сложный и обильный белковый груз, адаптированный к определенным функциональным потребностям. Отражая компонент малой РНК этих ELV (см. последующие разделы), также может быть, что ELV личиночной стадии Brugia являются в первую очередь носителями защищенной секреции РНК. Повторение проведенных здесь экспериментов может добавить глубины набору данных МС и идентифицировать дополнительные белки, связанные с ELV.

B. malayi ELVs содержат малые РНК, включая микроРНК с потенциальными мишенями-хозяевами

Мы исследовали препараты микровезикул личинок и взрослых особей на наличие малых видов РНК. Было обнаружено, что экзосомы содержат как некодирующие РНК (нкРНК), так и информационные РНК (мРНК) у различных видов и типов клеток. Особый интерес для нас представляло потенциальное присутствие малых некодирующих РНК, в том числе микроРНК (миРНК), которые потенциально могли бы обеспечивать связь между паразитами или модулировать экспрессию генов-хозяев.Малые виды РНК предпочтительно выделяли из предполагаемых содержащих ELV гранул и исследовали с помощью биоанализатора Agilent. Фракции микровезикул L3 B. malayi (24-часовая инкубация 300 червей) выявили обилие видов малых РНК в диапазоне 25–200 нт (рис. 4). Гораздо меньше РНК было обнаружено при инкубации взрослых самцов и самок B. malayi (24-часовая инкубация 30 взрослых червей), несмотря на гораздо более высокую массу ткани в культуральной среде для взрослых стадий. Это отсутствие корреляции между общим тканевым материалом паразита и выходом РНК в сочетании с разным качеством препаратов микровезикул личинок и взрослых особей по данным ЭМ дополнительно указывает на то, что высвобождение ELV в первую очередь характерно для паразитов на личиночной стадии и, возможно, более биологически значимо для ранних стадий. паразитарное заражение.

Рис. 4. Выделение малых РНК из фракций B. malayi ELV личинок и взрослых особей.

Данные биоанализатора показаны для РНК, выделенных из препаратов L3 взрослых самцов и взрослых самок Brugia . ELV L3 содержат значительное количество малых РНК в диапазоне 25–200 нт (маркированы эталонные пики 25 и 200 нт), в то время как препараты везикул взрослых самцов и самок дают меньше РНК. Фракции везикул готовили из 300 L3 и 30 взрослых особей при 24-часовой инкубации культур.Несмотря на гораздо более высокие общие количества тканей, используемые в культуре взрослых, мы обнаруживаем гораздо более высокие уровни малых РНК в ELV, происходящих из L3.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g004

Для более полного изучения содержания нуклеиновых кислот в этих недавно обнаруженных везикулах мы провели RNA-Seq как с L3 ELV, так и с тканевыми малыми РНК. Чтения, полученные с помощью секвенирования Illumina, были обработаны и использованы для заполнения конвейера обнаружения и оценки количества микроРНК с использованием miRDeep2 [47] (статистику чтения и необработанное количество микроРНК можно найти в таблице S1).Чтобы сравнить содержание ELV и клеточной РНК, экспрессию микроРНК нормализовали к общему количеству прочтений микроРНК в каждом образце. Открытие и профилирование микроРНК были дополнены данными ранее обнаруженных микроРНК у близкородственных видов нематод, чтобы помочь преодолеть пробелы в сборке проекта генома B. malayi (см. Методы). На рис. 5А сравнивается нормализованная экспрессия микроРНК между ELV и тканью для 20 наиболее распространенных микроРНК в каждом образце. Несмотря на значительную консервативность относительного содержания miRNAs, есть некоторые примечательные наблюдения и исключения.

Рис. 5. Обнаружение и профилирование микроРНК в экзосомоподобных везикулах B. malayi .

(A) Сравнительное содержание микроРНК в образцах L3 ELV и тканевых образцах . Обнаружение микроРНК и оценка количества были выполнены с использованием конвейера mirDeep2. 20 miRNAs с наивысшей экспрессией в каждом образце были сохранены для сравнения, а численность была нормализована по отношению к общему количеству прочтений картирования miRNA в каждом образце. Нормализованное количество прочтений нанесено на логарифмическую шкалу для ELV и тканевых микроРНК, чтобы обеспечить относительное упорядочение фракционного содержания.Bma-let-7 появляется только в субнаборе с высокой экспрессией, и ряд miRNAs с совершенной идентичностью зрелой последовательности с гомологами-хозяевами выделен (внешний синий кружок). (B) Сохранение последовательности между микроРНК B. malayi ELV-происхождения и комплементарной миРНК хозяина ( H. sapiens ). Уменьшенная тепловая карта, показывающая гомологию один к одному между данной микроРНК B. malayi и ее ближайшим совпадающим человеческим аналогом с точки зрения процентной идентичности. Bma-let-7, bma-miR-1, bma-miR-9, bma-miR-92 и bma-miR-100b (белые звездочки) имеют 100% идентичность с миРНК хозяина, в то время как bma-miR-34 демонстрирует высокая идентичность с микроРНК хозяина (21/23 нуклеотида).Эта субпопуляция микроРНК B. malayi (показана синим цветом) содержит потенциальные модуляторы экспрессии генов-хозяев. (C) Сохранение последовательности между B. malayi исходными сайтами miRNA происхождения ELV и хозяином ( H. sapiens ) исходными сайтами miRNA . miRNAs, разделяющие совершенно консервативные начальные сайты, определенные здесь как нуклеотиды 2–8 зрелой miRNA, отмечены (синие кружки).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g005

Bma-let-7 значительно обогащен ELV L3 по сравнению с тканью L3, где он не появляется среди 20 наиболее распространенных микроРНК.Bma-let-7, наряду с четырьмя другими зрелыми микроРНК B. malayi , обнаруженными в ELV (bma-miR-1, bma-miR-9, bma-miR-92 и bma-miR-100b), имеют идеальную последовательность идентичность со зрелыми микроРНК хозяина ( Homo sapiens ), как показано на рис. 5B. Кроме того, bma-miR-34 имеет почти полную идентичность последовательности со своим гомологом H. sapiens . 11 miRNAs B. malayi также имеют общие сайты семян с miRNAs H. sapiens (Fig 5C). Последовательности миРНК Brugia ELV были более широко сгруппированы по предполагаемому сайту зародыша и сопоставлены с миРНК паразитической нематоды Ascaris suum , передающейся через почву, свободноживущей модельной нематоды Caenorhabditis elegans и вида-хозяина млекопитающих H.sapiens и Mus musculus (рис. 6 и S1). Во всех случаях миРНК Brugia ELV, которые имеют общие сайты семян с миРНК хозяина, имеют один к одному ортологи A. suum . В некоторых случаях микроРНК паразита лучше сохраняются у хозяев-млекопитающих, чем у C. elegans (например, bma-miR-9, bma-miR-993 и bma-miR-100b/c).

Рис. 6. Brugia malayi Гомология последовательности миРНК ELV с миРНК нематод и млекопитающих-хозяев.

микроРНК из B.malayi , A. suum , C. elegans , H. sapiens и M. musculus были сгруппированы по идентичности последовательности исходного сайта (нуклеотиды 2–8) для множественного выравнивания последовательностей. Выравнивания показаны для bma-let-7, bma-miR-9 и bma-miR-993. bma-let-7 показан в качестве примера микроРНК Brugia ELV, которая демонстрирует сохранение как исходного сайта, так и полноразмерной последовательности, распространяющееся на другие паразитические и свободноживущие нематоды, а также на виды-хозяева млекопитающих.bma-miR-9 и bma-miR-993 представлены в качестве примеров, в которых консервативные микроРНК паразита имеют явные гомологи хозяина, но не имеют ортологов C. elegans один к одному. Полный набор центровок можно найти на S1 рис.

.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g006

Мы изучили комплемент наиболее распространенных микроРНК Brugia , связанных с ELV, относительно недавних исследований микроРНК, высвобождаемых другими видами паразитических нематод, и обнаружили циркулирующие в биожидкостях хозяина [26, 48–50].Общие маркеры включают let-7, lin-4, миР-34, миР-71, миР-92 и миР-100c (рис. 7А и 7В). В то время как все члены этого подмножества имеют идентичность последовательности исходного сайта с miRNAs хозяина млекопитающих, lin-4, miR-34, miR-71 и miR-100c в достаточной степени отличаются от miRNAs хозяина по их полной последовательности зрелой miRNA и потенциально могут служить биомаркеры филяриозной инфекции. Кроме того, мы сравнили комплементы 20 наиболее распространенных микроРНК Brugia ELV и H. polygyrus [26], идентифицировав шесть микроРНК, общих для этих везикул, и большое количество микроРНК, уникальных для каждого вида (рис. 7C).

Рис. 7. Сравнение миРНК B. malayi ELV с миРНК, секретируемыми другими видами паразитических нематод.

(A и B) Сравнение 20 наиболее распространенных микроРНК B. malayi ELV с комплементами микроРНК, обнаруженными в сыворотке и плазме дефинитивных и модельных хозяев-млекопитающих, отягощенных филяриатозной инфекцией ( Litomosoides sigmodontis [26] , Dirofilaria immitis [48], Loa loa [49], Onchocerca volvulus [48, 50], Onchocerca ochengi [49]). микроРНК D. immitis в (A) ограничены 20 наиболее распространенными микроРНК, а микроРНК O. volvulus в (B) представляют собой комбинацию двух неперекрывающихся наборов, полученных из отдельных отчетов. (C) Сравнение 20 наиболее распространенных микроРНК, идентифицированных в ELV B. malayi и экзосомах H. polygyrus . Эти анализы выявили наборы общих маркеров и ряд miRNAs, уникальных для каждого вида.

https://doi.org/10.1371/журнал.pntd.0004069.g007

Обогащение bma-let-7 и высокое фракционное присутствие других микроРНК паразита, имеющих полную или высокую гомологию с микроРНК хозяина, заставляет нас предположить о потенциальном ELV-опосредованном механизме, с помощью которого могут использоваться РНК паразита. эффективно управлять аспектами экспрессии генов в клетках-хозяевах. Мишенью эндогенных микроРНК семейства let-7 у позвоночных являются онкогены, а также гены, участвующие в пролиферации, апоптозе и врожденном иммунитете [51–53]. Let-7 сложным образом участвует в поляризации макрофагов и ответах на воздействие патогенов [31, 33, 54], и поэтому изменение экспрессии let-7 хозяина представляет собой потенциально выгодную точку вмешательства для вторгающегося паразита.Живые патогены подавляют экспрессию miRNAs семейства let-7, а let-7 miRNAs действуют на toll-подобные рецепторы (например, TLR4), которые непосредственно опосредуют ответы макрофагов [54–56]. Очевидно, существует важная связь между реакцией макрофагов на патогены и экспрессией let-7. Наше наблюдение, что B. malayi секретируют let-7 и другие потенциальные модуляторы экспрессии генов хозяина, указывает на механизм, с помощью которого можно манипулировать этим иммунным ответом хозяина. Подтверждая эту гипотезу, let-7 и другие миРНК с сохранением хозяина были идентифицированы в иммуномодулирующих H.polygyrus экзосомы взрослой стадии [26]. Чтобы полностью проанализировать эту гипотезу, необходимо широкое исследование взаимодействия микроРНК ELV и иммунных клеток-хозяев in vivo .

Brugia ELV интернализуются макрофагами хозяина Макрофаги

являются важными медиаторами раннего иммунного ответа на инвазивные паразиты Brugia [8]. Чтобы проверить гипотезу о том, что секретируемые Brugia ELV взаимодействуют с макрофагами хозяина, мы использовали флуоресцентные липофильные красители для визуализации взаимодействия между J774A.1 мышиные макрофаги и ELV. Эта клеточная линия была выбрана потому, что она коммерчески доступна, легко культивируется и повторяет биологию первичных макрофагов и дендритных клеток [57]. ELV были помечены PKH67, зеленым флуоресцентным красителем, и инкубированы с J774A.1, меченным PKH36, красным флуоресцентным красителем. Конфокальная микроскопия выявила эффективную интернализацию ELV этой клеточной линией макрофагов (рис. 8). Интернализация наблюдалась диффузно по всей клеточной цитоплазме с фокусом вокруг богатых мембранами точек, связанных с поверхностью макрофагов (рис. 8В).Этот паттерн интернализации согласуется с другими исследованиями, описывающими фагоцитарный путь интернализации везикул [58, 59]. Макрофаги контрастировали с DAPI для определения эффективности мечения клеток и поглощения ELV. РХ36-мечение J774A.1 было очень эффективным, и все клетки визуализировались, хотя интенсивность мечения была переменной (фиг. 8D). Приблизительно 40–50% макрофагов в той или иной степени интернализовали меченые ELV (рис. 8E), при этом примерно 10% макрофагов интернализовали ELV на значительно более высоких уровнях (рис. 8E).Не было обнаружено корреляции между сильным мечением PKH 26 макрофагов и поглощением везикул, что указывает на то, что интернализация не является фактором восприимчивости к мечению.

Рис. 8. Экзосомоподобные везикулы Brugia (ELV) интернализуются макрофагами J774A.1.

(A и D) Макрофаги J774A.1 были помечены РХ36 (красный) и контрастно окрашены DAPI (синий) для визуализации ядер. (B и E) B. malayi ELV стадии L3 были очищены от 24-часовой культуры паразита и помечены PKH67 (зеленый).3 × 10 5 J774A.1 совместно инкубировали примерно с 3 × 10 7 меченых ELV в течение 6 часов при 37°C и неоднократно промывали для удаления несвязавшихся ELV. Везикулы, интернализированные макрофагами, появляются диффузно по всей цитоплазме и сосредоточены в дискретных точках, связанных с клеточной мембраной. (C и F) Объединенные изображения, показывающие интернализацию ELV паразита. Все изображения были получены с использованием системы конфокального/многофотонного микроскопа Leica TCS SP5 X с объективами 20X (A-C) или 60X (D-F).Шкала баров: 10 мкм м (A-C) и 25 мкм м (D-F).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g008

Brugia ELV вызывают классический активированный фенотип в макрофагах хозяина

Активация макрофагов дихотомична; классически активированные макрофаги (CAMΦ) вызываются LPS или IFN- γ и обычно имеют провоспалительный фенотип, тогда как альтернативно активированные макрофаги (AAMΦ), активируемые IL-4 и IL-13, обладают иммунодепрессивным или противовоспалительным действием.Гельминтная инфекция обычно связана с путем AAMΦ, хотя и CAMΦ, и AAMΦ участвуют в иммунном ответе и иммунопатологии, вызванной инфекцией Brugia . Эксперименты демонстрируют, что различные препараты Brugia могут генерировать фенотипы активации как CAMΦ, так и AAMΦ; мертвые и умирающие черви и лизаты червей продуцируют CAMΦ [60], но живые черви и полные экскреторно-секреторные (ES) препараты управляют AAMΦ [61-63]. Чтобы проверить гипотезу о том, что ELV активируют макрофаги хозяина, J774A.1 лечили очищенными препаратами ELV и контролировали их реакции цитокинов/хемокинов. J774A.1 обрабатывали в течение 48 часов примерно 4 × 10 90 105 8 90 106 везикул стадии L3, очищенных от культуральной среды in vitro ультрацентрифугированием. Реакцию макрофагов анализировали с использованием набора Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokin Kit (EDM Millipore), сопряженного с системой Bio-Plex System (Bio-Rad) с использованием технологии Luminex xMAP, платформы, способной одновременно идентифицировать и количественно определять 32 цитокина/хемокина.Обработка везикул эффективно активировала макрофаги J774A.1 со значительным увеличением уровней G-CSF, MCP-1, IL-6 и MIP-2 по сравнению с контрольными макрофагами, обработанными наивной культуральной средой RPMI 1640 (p ≤ 0,001) (рис. 9A). Также было отмечено меньшее увеличение LIX, RANTES и TNF- α . Здоровые, жизнеспособные паразиты на стадии L3 давали почти идентичный ответ (рис. 9А), единственное отличие заключалось в умеренном, но значимом усилении стимуляции Г-КСФ жизнеспособными паразитами (p < 0,001), что позволяет предположить, что доминирующий иммуноген(ы) паразита находится в осадке везикул.Наконец, культуральные среды паразитов, из которых ELVs были удалены центрифугированием, не давали такой реакции, как и живые шистосомы ( S. mansoni cercaria) или их секретируемые везикулы (рис. S2), что позволяет предположить, что активация, связанная с Brugia , является специфической. к этому паразиту, а не к общей реакции на гельминтов или их секретируемые везикулы.

Рис. 9. Экзосомоподобные везикулы Brugia (ELV) вызывают классический активированный фенотип в макрофагах J774A.1.

(A) J774A.1 (5 × 10 5 ) обрабатывали приблизительно 4 × 10 8 очищенными ELV стадии L3, живыми паразитами стадии L3 (10 червей) или наивными культуральными средами (контроль) и супернатантами, собранными после 48 час. Присутствие 32 цитокинов/хемокинов одновременно анализировали с использованием набора Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokin Kit (EDM Millipore), сопряженного с системой Bio-Plex (Bio-Rad) с использованием технологии Luminex xMAP (Luminex). Представлена ​​количественная оценка идентифицированных цитокинов.Профиль цитокинов, генерируемый лечением ELV, согласуется с классически активированным фенотипом. (B) Цитокиновый ответ на лечение ELV сравнивается с LPS (200 нг/мл). Тесная корреляция ответов указывает на то, что лечение ELV приводит к классическому активированному фенотипу. (C) J774A.1 (5 × 10 5 ) обрабатывали высокой дозой ЛПС (200 нг/мл), низкой дозой ЛПС (0,003 нг/мл), ELV или интактной культуральной средой (контроль) в течение 24 часов, супернатант собраны и проанализированы на G-CSF с использованием набора Quantikine ELISA для мыши G-CSF (R&D Systems).Отсутствие ответа на низкие дозы LPS предполагает, что классически активированный ответ не связан с LPS-подобным загрязнением.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004069.g009

Наблюдаемый профиль активации будет считаться более показательным для ответа CAMΦ, чем AAMΦ; чтобы подтвердить, что ответ был CAMΦ-подобным, мы сравнили его с ответом, вызванным ЛПС (200 нг/мл). Единственным существенным отличием было то, что лечение ELV менее эффективно стимулировало G-CSF и IL-6 (p < 0.001) и стимулировал MCP-1 более эффективно (p < 0,001), чем LPS (фиг. 9B). Однако общая консервация ответа указывает на то, что эти ELV генерируют фенотип CAMΦ. Так как Wolbachia , эндосимбионт, присутствующий в филяриатозных нематодах, лишен способности к биосинтезу ЛПС, маловероятно, что наш CAMΦ-подобный ответ был обусловлен контаминацией, подобной ЛПС, но чтобы исключить это, уровни эндотоксина в нашем препарате везикул определяли на коммерческой основе (Lonza, Walkersville , доктор медицинских наук). Присутствовала LPS-подобная активность (0.003 нг/мл), но в концентрации на несколько порядков ниже минимальной дозы, необходимой для стимуляции макрофагов J774A.1 [64]. Как и ожидалось, обработка макрофагов такой низкой дозой ЛПС была недостаточной для активации (рис. 9С), что указывает на то, что наблюдаемый нами ответ САМΦ не связан с ЛПС-подобным компонентом в нашем препарате.

Поскольку стимуляция фенотипа AAMΦ живым Brugia и его препаратами ES in vivo и in vitro хорошо известна [61–63], можно ожидать, что препараты Brugia ELV также стимулируют фенотип AAMΦ , тем более, что полные препараты Brugia ES, вероятно, будут включать ELVs, подобные рассмотренным здесь, хотя и в уменьшенных концентрациях.Однако мы наблюдали ответ, соответствующий фенотипу CAMΦ, хотя без острого повышения продукции IL- β и TNF- α , которые другие наблюдали в ответ на LPS [60]. Одна интерпретация заключается в том, что фенотип CAMΦ > AAMΦ может быть несколько искусственной функцией гомогенной монокультуры J774A.1, используемой здесь, поскольку в других исследованиях, описывающих фенотип AAMΦ, часто используют PBMC или другие гетерогенные типы первичных клеток. Было бы поучительно отслеживать реакцию таких смешанных клеточных популяций на препарат ELV.Кроме того, хотя мышиная модель считается ценной для освещения того, как паразиты закрепляются, и раннего иммунного ответа хозяина, J774A.1 может быть не оптимальным для изучения этого конкретного взаимодействия Brugia с хозяином, а оптимизация с другими мышиными или человеческими клетками может быть обязательным. Другая интерпретация, однако, заключается в том, что исследованные здесь очищенные ELV следует рассматривать как отдельную и специфическую фракцию очень сложного иммуногенного фасада, представленного филяриатозными паразитами, и могут выявить настоящий фенотип CAMΦ при изолированном исследовании.Поддерживая эту интерпретацию, экзосомы, выделенные из других биологических систем, эффективно генерируют фенотип CAMΦ [59, 65, 66]. Ключевым медиатором этого провоспалительного ответа является Hsp70 [65], который был идентифицирован в нашем протеомном профиле ELV. Таким образом, независимо от полярности фенотипа активации макрофагов, наши результаты однозначно идентифицируют секретируемые ELV как отдельные структуры паразитарного происхождения, способные активировать иммунную систему хозяина.

Складывается впечатление, что паразитические гельминты выделяют функциональные экзосомоподобные везикулы.Белок и малая РНК, содержащиеся в этих везикулах, обладают предполагаемыми эффекторными функциями на границе хозяин-паразит и потенциально служат для создания условий, благоприятных для установления или поддержания инфекции. Идентификация этих межклеточных эффекторных структур интересна и побуждает к дальнейшим исследованиям их функциональной значимости. В частности, будет важно описать роли отдельных miRNAs и белков, содержащихся в ELVs, чтобы идентифицировать молекулярные мишени хозяина, которыми манипулируют in vivo , и выявить любые законсервированные или специфичные для стадии эффекторы, секретируемые на протяжении жизненного цикла паразита.Другой интригующий вопрос заключается в том, существует ли какая-либо специфичность или селективность в клетках-хозяевах или тканях-мишенях, и если да, то какие молекулярные механизмы подчеркивают эту специфичность. Ответ на такие вопросы прольет свет на фундаментальные взаимодействия, которые происходят между паразитом и хозяином, и может открыть ранее неиспользованные возможности для борьбы с паразитами и диагностики.

Материалы и методы

Уход за комарами

Aedes aegypti (ливерпульский штамм Black Eyed, LVP), ранее отобранный на чувствительность к заражению штаммом Brugia malayi [67], содержали в контролируемых условиях (27°C ± 1°C и относительная влажность 75% ± 5%). ) с фотопериодом 16:8.Взрослых комаров кормили 10% сахарозой. Приблизительно 4000 и 2600 комаров были использованы для протеомики и секвенирования РНК соответственно.

Установление инфекции

Brugia malayi

Для протеомики и транскриптомики кровь кошки, инфицированной B. malayi microfilaria (mf), была получена из Ресурсного центра исследований реагентов для исследования филяриатоза Национального института здравоохранения штата Джорджия (FR3). Кровь, содержащую паразитов, разбавляли дефибринированной овечьей кровью (Hemostat Laboratories, Калифорния, США) до достижения концентрации 80–100 мф на 20 мк л.Чтобы установить инфекцию, 3–5-дневные Ae. Aegypti (LVP) кормили в течение одного часа через кормушку со стеклянной мембраной. Комаров голодали по сахарозе в течение 24 часов до кормления кровью, а тех, кто не принимал кровь, удаляли. Зараженных комаров содержали в описанных выше условиях в течение 13–15 дней после заражения (dpi), чтобы обеспечить развитие паразитов.

Brugia malayi техническое обслуживание и сбор сред, содержащих везикулы

В поисковых исследованиях личинки (300 L3) и взрослые особи (30 самцов или 30 самок) B.malayi были приобретены у FR3. По прибытии паразитов культивировали в 50 мл RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) при 37°C (5% CO 2 ). Среду для культивирования клеток собирали и заменяли с интервалом в 24 часа на срок до 72 часов для сбора секретируемых ELV. Для последующего секвенирования и протеомики локально собрали B. malayi (13–15 dpi) с использованием методов, описанных FR3. Вкратце, инфицированных комаров обездвиживали путем охлаждения до 4°С в течение 15 минут. Иммобилизованных комаров измельчали ​​в ступке, содержащей 5 мл охлажденного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS, pH 7.0), содержащие пенициллин (0,4 ЕД пенициллина/мл, 0,4 мкг стрептомицина/мл). Затем комаров ополаскивали через сито 150 меш, содержащееся в пластиковой чашке Петри с глубокими лунками, и промывали 3–4 раза, используя свежеохлажденный HBSS + пен-стрептококк. Затем сита помещали в чашки Петри, содержащие теплый (40°C) HBSS + стрептококк пера, чтобы обеспечить миграцию инфекционных личинок. Сита переносили в новые чашки Петри с глубокими лунками, содержащие свежий теплый HBSS, каждые 30 минут. Собранных паразитов дважды промывали теплым HBSS + пен-стрептококк, помещали в 25 мл RPMI 1640, содержащую пен-стрептококк (0.4 единицы пенициллина/мл, 0,4 мкг стрептомицина/мл) и выдерживали при 37°C, 5% CO 2 в течение 24 часов для сбора секретируемых ELV.

Очистка экзосомоподобных везикул

Дифференциальное центрифугирование использовали для выделения ELV из аликвот по 25 или 50 мл культуральной среды Brugia . Аликвоты собирали в результате 24-часовой инкубации личинок или взрослых червей в культуральной среде. Стадии центрифугирования и фильтрации с более низкой скоростью использовались для удаления загрязняющих клеток (300 × g, 10 минут) и клеточного дебриса (10 000 × g, 15 минут).Полученные супернатанты подвергали фильтрации через фильтры 0,22 мкм мкм и ультрацентрифугированию при 105000×g в течение 90 минут для осаждения ELV. Затем гранулы промывали холодным фосфатно-солевым буфером (PBS) и проводили окончательное вращение при 105000×g в течение 90 минут. Супернатанты удаляли, а осадки ресуспендировали в небольших объемах (30–250 мкл) PBS для визуализации, секвенирования и протеомики, а также в RPMI для иммунологических анализов. Образцы хранили на льду и проводили стадии центрифугирования при 4°C.Ресуспендированные ELV хранили при -80°C.

Электронная микроскопия и анализ слежения за наночастицами

Небольшие аликвоты суспензии ELV (3 мкл л) наносили на покрытые углеродом медные сетки 200 меш и подвергали отрицательному окрашиванию 2% уранилацетатом. Изображения были получены с использованием сканирующего и просвечивающего электронного микроскопа JEOL 2100 (Japan Electron Optics Laboratories, Akishima, Japan) в Центре микроскопии и наноизображения (Университет штата Айова). Анализ отслеживания наночастиц проводили с помощью NanoSight LM10 (NanoSight Ltd., Эймсбери, Великобритания), чтобы установить размер и частотное распределение отдельных препаратов везикул, проанализированных в трех повторностях. Броуновское движение частиц в растворе обратно связано с размером и количеством частиц, что позволяет получить лучшее статистическое разрешение размера и концентрации везикул [68].

ЖХ-МС/МС и протеомный анализ

Белок был выделен из очищенных экзосомоподобных везикул для протеомного анализа (System Biosciences). Вкратце, образцы модифицировали 10% SDS до конечной концентрации 2% SDS, нагревали при 100°C в течение 15 минут и осветляли центрифугированием.Концентрацию белка определяли с помощью флуорометрического анализа Qubit (Invitrogen). 15 мкл г материала обрабатывали методом SDS-PAGE с использованием гомогенного геля 10% Bis-Tris и буферной системы MES. Расщепление в геле трипсином проводили при 37°C в течение 4 часов с использованием робота ProGest (DigiLab, Мальборо, Массачусетс). Расщепленный образец анализировали методом нано ЖХ-МС/МС с использованием системы ВЭЖХ Waters NanoAcquity, соединенной с ThermoFisher Q Exactive. Данные были сопоставлены с копией B.malayi База данных UniProt (идентификатор таксона: 6278) с использованием локальной копии MASCOT (Matrix Science Ltd., Лондон, Великобритания). Поиск был ограничен по следующим параметрам; максимальное количество пропущенных расщеплений = 2, фиксированные модификации = карбамидометил (C), переменные модификации = окисление (M), ацетил (N-конец), Pyro-Glu (N-конец Q) и дезамидирование (N, Q), устойчивость пептида к массе 10 частей на миллион и допуск массы фрагмента 0,02 Да. Файлы Mascot DAT были проанализированы в программном обеспечении Scaffold для проверки, фильтрации и создания неизбыточного списка для каждого образца.Данные были отфильтрованы с использованием минимального значения белка 90%, минимального значения пептида 50% (баллы Prophet) и требовалось по крайней мере два уникальных пептида на белок.

Выделение и секвенирование РНК

Для обнаружения видов РНК в препаратах ELV малые РНК предпочтительно выделяли из содержащих везикулы гранул с использованием набора для выделения РНК miRCURY (Exiqon, Vedbaek, Дания), а образцы РНК исследовали на биоанализаторе Agilent 2100 с использованием набора RNA 6000 Nano. Для секвенирования малых РНК (RNA-Seq) общую РНК выделяли из ELV, высвобождаемых примерно 5000 L3 в течение 24-часового периода инкубации, с использованием набора для выделения общей РНК и белка (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния).Параллельно с этим из цельной ткани червя выделяли общую РНК с использованием протокола TRIzol (Invitrogen), где проводили 6-часовую стадию осаждения при -80°C для улучшения извлечения малых РНК. Библиотеки РНК NGS были сконструированы с использованием модифицированных методов адаптера Illumina с использованием набора SBI для подготовки образцов XRNA (System Biosciences, Mountain View, CA) и проиндексированы с помощью отдельных штрих-кодов для мультиплексного секвенирования на приборе Illumina MiSeq v3 с использованием 2 × 75 п.н. .

Открытие микроРНК и оценка распространенности

Необработанные чтения были обрезаны для удаления последовательностей адаптеров, отфильтрованы по показателю качества и демультиплексированы с использованием FASTX-Toolkit [69] (данные секвенирования депонированы в NCBI SRA под номером проекта PRJNA285132).Конвейер miRDeep2 использовали для картирования коротких прочтений РНК (> 15 нт) с геномом B. malayi для обнаружения микроРНК, а также для оценки и нормализации количества микроРНК по отношению к общему количеству прочтений микроРНК. Последовательности предшественников нематод и зрелых микроРНК, депонированные в miRBase [70], включали известные B. pahangi , Caenorhabditis elegans , Ascaris suum , Haemonchus contortus и Strongyloides.Некартированные чтения были ранжированы по распространенности, отфильтрованы на предмет гомологии с известными миРНК в типе Nematoda с использованием BLASTn [71] и включены для окончательной количественной оценки численности с помощью квантификаторного скрипта miRDeep, позволяющего захватывать миРНК, которые не картировались на . Сборка B. malayi из-за пробелов в последовательности. Пакет ggplot2 [72] языка статистического программирования R использовали для организации и визуализации сравнений образцов везикулярной и тканевой РНК.

Культура клеток

Макрофаги мыши J774A.1 (ATCC, Манассас, Вирджиния) поддерживали в полной среде для культивирования тканей (среда Игла, модифицированная Дульбекко, 25 мМ HEPES, pH 7,4 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мк г/мл стрептомицина, 0,05 мк М 2-меркаптоэтанола и 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) при 37°C и 5% CO 2 . За 24 часа до анализа 400 мкл л клеток высевали в стандартные 24-луночные планшеты с плотностью 5×10 5 клеток/лунку.

Маркировка и поглощение везикул

Экзосомоподобные везикулы были очищены из 24-часовой культуры 300 паразитов Brugia malayi L3, как описано выше, и помечены зеленым флуоресцентным красителем PKH67 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с инструкциями производителя. . ELV инкубировали с PKH67 в течение 5 минут при комнатной температуре, и реакцию останавливали добавлением 1% BSA в PBS. Добавляли среду RPMI 1640, перемешивали и центрифугировали при 105 000 × g в течение 1 часа, чтобы отделить PKH67, связанный с ELV, от избытка PKH67.Меченый ELV снова промывали, а затем ресуспендировали в соответствующем объеме полной среды для культивирования тканей (среда Иглса, модифицированная Дульбекко, 25 мМ HEPES, pH 7,4 с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг мкг/мл стрептомицина). , 0,05 мк М 2-меркаптоэтанола и 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки).

J774A.1 метили красным флуоресцентным липофильным красителем РХ36 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в соответствии с инструкциями производителя. Макрофаги инкубировали с ПХ36 в течение 5 мин при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 1% БСА.Для удаления избытка несвязавшегося красителя образцы центрифугировали при 400×g в течение 10 минут при комнатной температуре и отбрасывали надосадочную жидкость. Центрифугирование повторяли еще три раза с использованием 10 мл полной среды для полного удаления несвязавшегося красителя, и клетки ресуспендировали в 1 мл полной среды. Приблизительно 3 × 10 5 меченых клеток высевали на стерильные покровные стекла и инкубировали в течение ночи при 37°C/5% CO 2 . Меченую суспензию ELV (примерно 3 × 10 90 105 7 90 106 на покровное стекло) добавляли к меченому J774A.1 и инкубировали в течение 6 часов. Клетки 5 раз промывали ледяным PBS для удаления избытка меченых ELV, клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma-Aldrich), промывали и докрашивали DAPI перед установкой и хранением при 4°C. Препараты визуализировали с использованием системы конфокального/многофотонного микроскопа Leica TCS SP5 X (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL).

Обнаружение модуляции макрофагов с помощью анализа Luminex

Три лунки с прикрепленным J774A.1 обрабатывали примерно 4 × 10 8 очищенными ELV стадии L3.ELV очищали ультрацентрифугированием, как описано ранее, ресуспендировали в среде RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и количественно определяли с помощью анализа отслеживания наночастиц. Другие обработки включали аналогичные объемы обедненной везикулами культуральной среды L3 (супернатант, созданный после осаждения фракции ELV из отработанной культуральной среды паразитов), живых паразитов B. malayi L3 (10 червей/лунку), липополисахарида (LPS; конечная концентрация 200 нг/лунку). мл) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури), наивную культуральную среду RPMI 1640 и различные комбинации этих условий.Супернатанты этих клеточных культур (400 мкл л/лунку) собирали через 24 или 48 часов после обработки и кратковременно центрифугировали (2000×g в течение 10 минут) для удаления неприлипших клеток и клеточного детрита перед анализом на наличие цитокины/хемокины. Набор Milliplex MAP Mouse Cytokine/Chemokin Kit (EDM Millipore, Billerica, MA), соединенный с системой Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием технологии Luminex xMAP (Luminex, Остин, Техас), позволил одновременно идентифицировать и количественно определить следующие аналиты в супернатанте клеточной культуры: эотаксин, G-CSF, GM-CSF, IFN γ , IL-1 α , M-CSF, IL-1 β , IL-2, IL-3, Ил-4, Ил-5, Ил-6, Ил-7, Ил-10, Ил-12(п40), Ил-13, Ил-15, Ил-17, ИП-10, МИП-2, КС, ЛИФ , LIX, MCP-1, MIP-1 α , MIP-1 β , MIG, RANTES, TNF α , IL-12(p70), VEGF, IL-9.Вкратце, экспериментальные образцы, фон, стандарты и контроли добавляли в 96-луночный планшет и объединяли с равными объемами предварительно смешанных магнитных шариков, покрытых антителами; планшет запечатывали и инкубировали в течение ночи при 4°С. После промывки добавляли 25 мкл мкл детектирующего антитела и планшет инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре при встряхивании. В каждую лунку добавляли стрептавидин-фикоэритрин (25 мкл л) и инкубировали планшет еще в течение часа при комнатной температуре перед промывкой.Наконец, во все лунки добавляли 150 мкл мкл буфера для анализа и немедленно регистрировали флуоресценцию. Данные средней интенсивности флуоресценции анализировали в соответствии с рекомендациями с использованием пятипараметрического метода подбора логистической кривой для расчета концентрации цитокинов/хемокинов.

Г-КСФ ИФА

Три лунки с прикрепленными клетками J774A.1, подготовленными, как описано выше, обрабатывали ЛПС (конечная концентрация 200 нг/мл или 0,003 нг/мл), примерно 4 × 10 8 очищенных ELV стадии L3, как описано выше, или RPMI 1640 в качестве отрицательного контроля.Супернатанты клеточных культур собирали через 24 часа после обработки, очищали центрифугированием, как описано ранее, и анализировали на наличие G-CSF с использованием набора ELISA для мышиного G-CSF Quantikine (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота). Стандартные кривые были построены с использованием программного обеспечения Prism 6 (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния) и концентрации G-CSF в образцах, определенные с помощью регрессионного анализа.

Статистический анализ

Для анализа данных Luminex критерий Тьюки использовался для сравнения общего лечения, в то время как множественные t-тесты, включающие метод Холма-Сидака для корректировки множественных сравнений, использовались для сравнения отдельных хемокинов/цитокинов после лечения.Стьюдентные тесты использовались для сравнения групп лечения после анализа ELISA. Все статистические анализы проводились с использованием Prism 6 для Mac (Graphpad).

Book Reviews — Page 17 — Бормотание Махабора

Реклама Goodreads : Индийский субконтинент был землей иммигрантов на протяжении тысячелетий: волны миграции из Персии, Средней Азии, Монголии, Ближнего Востока и Греции помогли создать в Индии исключительно разнообразный культурный микс. За столетия до британского владычества, когда Моголы были выдающейся силой на субконтиненте, множество мигрантов, известных как «фиранги», сделали Индию своим домом.В этой книге их истории рассказывает Джонатан Джил Харрис, фиранги двадцать первого века.

Эти захватывающие рассказы о целителях, солдатах, художниках, аскетах, ворах, пиратах и ​​куртизанках, которые не были могущественными или привилегированными. Часто они спасались от бедности или религиозных преследований; многих привезли сюда в качестве рабов; другие просто следовали своему духу приключений. Некоторые из этих мигрантов были поглощены армией. Другие присоединились к религиозным общинам — католики Рахола, подпольные евреи Гоа, факиры Аджмера, суфии Дели.Целители из Португалии и Италии адаптировали свою врачебную практику в соответствии с местными традициями. Одаренные ремесленники из Европы присоединились к королевским ателье Акбара и Джахангира и помогли создать непреходящие произведения искусства. И хотя в архивных записях это почти незаметно, некоторые женщины-мигранты, такие как армянка Биби Джулиана и португалька Юлиана Диас да Кошта, нашли дом в королевских гаремах Великих Моголов.

Джонатан Гил Харрис использует свой собственный опыт становления индейцем в процессе акклиматизации к культуре, обычаям, погоде, еде, одежде и обычаям страны, чтобы оживить истории этих призрачных фигур.

—————

Прежде всего позвольте мне признаться, что я был чрезвычайно задет названием книги и ее аннотацией, прежде всего потому, что большая часть того, что я знаю об истории Индии до восстания сипаев 1857 года, было тем, что я читал в своих учебниках по истории, а иногда и в Амарских книгах. Читра Катха в молодости. И в тех случаях, когда у меня была возможность прочитать об этом увлекательном периоде индийской истории, я был более чем ошеломлен интересным стечением обстоятельств, в которых оказалась наша страна в эти дни, особенно за несколько дней до «Востока». Сюда прибыла индийская компания и ее британские сотрудники.И не будет преувеличением сказать, что эта книга более чем удовлетворила мое любопытство в этом отношении и в процессе разожгла вновь обретенный интерес к этому периоду индийской истории больше, чем когда-либо прежде.

В то время как сама книга пытается рассказать истории о, казалось бы, разрозненных людях, у которых есть только одна общая нить, состоящая в том, что они обосновались в Индии, в основе книги лежит Индия, индийцы и, что более важно, «индейство» и то, что нужно для того, чтобы на самом деле «быть индейцем» более чем одним способом.Автор очень ловко завлекает читателей, рассказывая о своем первом опыте в Индии и о своих доморощенных методах справиться со страной и ее влиянием на его разум и тело. И, ловко используя человеческое тело и страдания, которым оно подвергается в новой среде, в качестве метафоры опыта «фиранги» в Индии, Джонатан Гил Харрис продолжает вести хронику некоторых из менее известных иностранцев в Индии.

Ниже приведены мои наблюдения почти обо всех переживаниях отдельных иностранцев, описанных автором в этой книге, но будьте уверены, никаких «спойлеров» не было выдано.

В первых двух главах рассказывается о тонком, но заметном влиянии индийской еды и, в частности, фруктов на «фиранги» Гарсию Де Орта и Томаса Стивенса, а в следующей главе рассказывается о трех рабах-воинах Малике Аязе, Чинали и Дилланаи и их соответствующих историях. как они попали в армии и сердца своих индийских хозяев.

История Малика Амбара и его вклада в зарождение и развитие партизанской войны в районах Северного Декани Махараштры является следующей главой, в то время как истории Наккаша и Джавахери при дворе Джахангира, где фиранги продемонстрировали образцовое знание и понимание изобразительное искусство Великих Моголов в живописи и изготовлении ювелирных изделий — довольно хорошая глава.

Главы о двух женщинах-фиранги, которых зовут Юлианы, представляют интерес для чтения, хотя и не так интересны, как некоторые из предыдущих глав. Но это компенсируется удивительно интересной историей Томаса Кориата, который был в такой же степени артистом, как и путешественником, и одним из тех редких фиранги, которым удалось ассимилировать как можно больше местных культур, с которыми он столкнулся во время своих путешествий или «мучений». ‘, как он их называл.

Интересный персонаж по имени Саид Сармад Кашани, который, помимо всего прочего, больше всего запомнился своей наготой, которой он придерживался почти всю вторую половину своей жизни.В этой конкретной истории фиранги более чем достаточно мяса, чтобы привлечь внимание читателей, склонных к философии и духовности.

Далее следует небольшой, но интересный рассказ о короле пиратов-фиранги Себастьяне Гонсалвесе Тибау из восточного прибрежного города Читтагонг в Бенгалии, который будет интересен для чтения, особенно для тех, кто, как и я, наслаждался серией фильмов «Пираты Карибского моря».

Причудливая история Николаса Мануччи, который, похоже, питал «расовую» ненависть ко всем неевропейцам, но все же сумел успешно вести довольно яркую жизнь в Индии в течение как минимум четырех десятилетий или около того.Настолько, что он, кажется, стал более «индейцем», чем любой из других фиранги, упомянутых в этой книге.

В заключение я воспроизведу одно из последних нескольких предложений в этой книге: « можно даже сказать, что подлинное Индийское никогда не может быть отождествлено с единственной траекторией, а, скорее, всегда было серией прерываний и творческих ответов на эти прерывания », и это, в двух словах, то, о чем эта книга; самые ранние фиранги, которые прибыли в Индию по разным причинам разными путями, но остались там, несмотря на все препятствия, с которыми они столкнулись, и процветали, чтобы стать «подлинно индийским» , что во многих отношениях отражает собственную жизнь, личность и выбор автора.

Нажмите на следующую ссылку, чтобы купить книгу в Flipkart [Ссылка] .

—————

Отказ от ответственности: Издатели предложили мне рецензию на эту книгу в обмен на честный и непредвзятый обзор.

Нравится:

Нравится Загрузка…

| Различия в самоотчетах о негативном настроении после воздействия…

Было обнаружено, что синие пространства обладают значительным салютогенным эффектом. Однако мало что известно о механизмах и путях, связывающих синие пространства и здоровье.Целью этого систематического обзора и метаанализа является обобщение данных и количественная оценка влияния синих пространств на четыре гипотетических промежуточных пути: физическую активность, восстановление, социальное взаимодействие и факторы окружающей среды. Следуя рекомендациям PRISMA, был проведен поиск литературы с использованием шести баз данных (PubMed, Scopus, PsycInfo, Web of Science, Cochrane Library, EBSCOHOST/CINAHL). В наш систематический обзор было включено 50 исследований. Общее качество включенных статей, оцененное с помощью инструмента Qualsyst, было оценено как очень хорошее, поскольку ни у одного из путей-посредников среднее качество статей не превышало 70%.Метаанализ случайных эффектов был проведен для физической активности, восстановления и социального взаимодействия. Жизнь ближе к голубому пространству была связана со статистически значимо более высоким уровнем физической активности (Коэн d = 0,122, 95% ДИ: 0,065, 0,179). Более короткое расстояние до синего пространства не было связано с восстановлением (d Коэна = 0,123, 95% ДИ: -0,037, 0,284) или социальным взаимодействием (Коэн d = -0,214, 95% ДИ: -0,55, 0,122). Большее количество синего пространства в пределах географической области было значительно связано с более высокими уровнями физической активности (Коэн d = 0.144, 95% ДИ: 0,024, 0,264) и более высокие уровни восстановления (Коэн d = 0,339, 95% ДИ: 0,072, 0,606). Более тесный контакт с синим пространством был значительно связан с более высокими уровнями восстановления (Коэн d = 0,191, 95% ДИ: 0,084, 0,298). Есть также доказательства того, что синие пространства улучшают факторы окружающей среды, но для проведения метаанализа необходимы дополнительные исследования. Данные о посреднических эффектах социального взаимодействия противоречивы, и требуются дальнейшие исследования этого гипотетического пути.Голубые пространства могут частично решить проблемы общественного здравоохранения, с которыми сталкивается растущее городское население во всем мире.

Нарушение цилиогенеза при дифференциации бронхиального эпителия человека, подвергшегося воздействию нецитотоксических доз многостенных углеродных нанотрубок | Токсикология частиц и волокон

Характеристика наноматериалов

Характеристика многостенных углеродных нанотрубок (МУНТ), использованных в этом исследовании, была опубликована ранее [16, 35]. Вкратце, МУНТ были приобретены у Helix Nanomaterial Solutions и синтезированы методом химического осаждения из паровой фазы.Содержание элементарного углерода составляло >95%, примеси каталитических металлов никеля и лантана <0,2 и <0,1% соответственно. Нанотрубки имеют диаметр 10–30 нм и длину 500–4000 нм, как определено с помощью ПЭМ.

Мезопористый графитированный наноуглерод (NG) использовался в концентрации 4 мкг/см2 в качестве контрольной частицы, поскольку он обладает аналогичным химическим составом графитированной поверхности без трубчатой ​​формы и соотношения сторон МУНТ. NG был приобретен у Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и имел высокую чистоту (>99%).

Дополнительную информацию о характеристиках наноматериалов, использованных в этом исследовании, можно найти в дополнительном файле 1. ). Клетки выращивали в погруженной культуре на среде BEGM (Lonza) и замораживали после 1 пассажа. Размороженные BEC высевали на 12 мм стоячие пористые вставки Millicell (EMD Millipore, Дармштадт, Германия) при ~10 5 клеток/см 2 в среде дифференцировки ALI [36] (Университет Северной Каролины, Лаборатория муковисцидоза).Человеческий коллаген IV использовали для покрытия вставных мембран за 24 часа до посева. Культурам давали достичь слияния при погружении в среду ALI перед обработкой наноматериалами. Затем культуры обрабатывали в апикальной камере только 0, 0,25 или 1 мкг/см 2 (0, 0,75 и 3 мкг/мл соответственно) МУНТ или 4 мкг/см 2 (12 мкг/мл) НГ. диспергировали в среде ALI с добавлением 10 мкг/мл 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DPPC) и 600 мкг/мл стерильного бычьего сывороточного альбумина (BSA).Как суспензии наноматериалов, так и контрольную среду диспергировали с помощью ультразвука в чашечном рожке (Misonix, Farmingdale, NY) при амплитуде 100 в 5 импульсах по 3 минуты каждый, заменяя чашечный рожок холодной водой между импульсами. Измерения динамического светорассеяния (DLS) агломератов нанотрубок в этом растворе носителя имели гидродинамические диаметры от 10 до 200 нм, а агломераты графитированного углерода образовались от 20 до 150 нм, как показано ранее [16]. Суспензии наноматериалов были динамичными, и наноразмерные агрегаты оседали в более крупные агломераты размером 1+ мкм в течение нескольких часов (см. Дополнительный файл 1), поэтому концентрация в мкг/мл является более точной в первые несколько часов, в то время как концентрация в мкг/см более уместно, когда подвеска полностью отстоялась.После 24-часовой инкубации с наноматериалами среду для обработки удаляли из апикальной камеры, чтобы преобразовать вставки в культуры на границе раздела воздух-жидкость (ALI). Культуры промывали средой ALI сразу после удаления апикальной обработки и во время замены среды базальной камеры каждые 2 дня до фиксации/сбора через 28 дней после воздействия. В этом исследовании использовалась фиксированная временная точка в 28 дней, чтобы позволить культурам от нескольких доноров полностью дифференцироваться и контролировать различные скорости дифференцировки у каждого донора, хотя все они полностью дифференцировались до 20-го дня.Также была исследована группа лечения после дифференцировки, в которой необработанным культурам давали возможность дифференцироваться в ALI в течение 20 дней, а затем обрабатывали 1 мкг/см 2 MWNCT в течение 24 часов. Эти клетки фиксировали через 7 дней после обработки, на 28-й день дифференцировки.

Анализ лактатдегидрогеназы

Цитотоксичность в результате воздействия наноматериала измерялась по высвобождению лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в апикальную камеру. Апикальные камеры промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) за 24 часа до сбора, и накопленную ЛДГ, собранную во время второй апикальной промывки, определяли количественно с помощью колориметрического анализа CytoTox 98 (Promega, Мэдисон, Висконсин).Поглощение при 495 нм за счет превращения продукта формазанового красителя указывало на повышение концентрации ЛДГ и повышенную цитотоксичность. Общий накопленный за 24 часа выброс ЛДГ был нормализован по отношению к контрольному уровню ЛДГ (дополнительный файл 2). Хотя было показано, что МУНТ мешают колориметрическим анализам, таким как этот [37], мы продемонстрировали в предыдущей работе [16], что относительно низкие концентрации, которые мы используем, не оказывают существенного влияния на результаты анализа. Результаты бесклеточных анализов, содержащих только MWCNT или NG, были вычтены из результатов обработки, чтобы учесть прямое поглощение 495 нм этими материалами, хотя эти лунки существенно не отличались от холостой среды (не показано).

Иммуноцитохимия всего препарата

Культуральные вставки фиксировали на 28 день после обработки и удаления апикальной среды (ALI день 28). Вставки промывали PBS для удаления слизи и фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) EM-grade на 30 мин. Клетки пермеабилизировали 0,2% TritonX-100 в PBS в течение 30 мин, снова промывали PBS и блокировали (раствором 1% BSA, 1% рыбьего желатина, 0,1% Triton-100 и 5% козьей сыворотки в PBS). в течение 1 ч при комнатной температуре. Первичную инкубацию с крысиным антитубулиновым mAb, клоном YL1/2 (EMD Millipore, Дармштадт, Германия, разбавленный до 5 мкг/мл в блокирующем растворе) проводили в течение ночи при 4°C.Лунки промывали 3 раза по 30 минут в 25% блокирующем растворе в PBS перед добавлением Alexa488-конъюгированного фаллоидина (Thermo Fisher, Waltham, MA, 1:200) и вторичного антитела против крыс Alexa647 (Thermo Fisher, Waltham, MA, 1: 200). Вторичную инкубацию проводили в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего мембраны промывали PBS 3 раза по 5 минут каждую, вырезали из их пластиковых литников и помещали на предметные стекла с Prolong gold plus DAPI (Thermo Fisher, Waltham, MA). . Z-стеки, взятые с 10 мкм апикальной поверхности каждой мембраны, визуализировали с помощью конфокального микроскопа Zeiss 710.Такие параметры, как усиление, точечное отверстие, интенсивность лазера, z-плоскости на стопку и постобработка изображения, сохранялись постоянными между процедурами. Восемь z-стеков были взяты из случайно выбранных мест в центре каждой мембраны и использованы для получения проекций максимальной интенсивности. Анализ площади пикселей этих проекций (с использованием программного обеспечения Image J) использовали для количественного определения окрашивания цилиарного тубулина и F-актина в плотных соединениях. Площади пикселей были нормализованы по окрашиванию ядер DAPI для учета сниженной клеточности; однако клеточность не изменилась ни при каком лечении (см. Дополнительный файл 4).

Гистологический поперечный срез

Трансвеллы ALI на 28-й день фиксировали 4% PFA и обезвоживали в пластиковых кассетах с погружением на 15 минут в этанол (70%, 70, 90, 90, 95, 100, 100% и 100%) с последующим три 15-минутных погружения в заменитель ксилола NeoClear (EMD Millipore, Дармштадт, Германия) перед заливкой в ​​парафин на ночь. Поперечные срезы дифференцированных мембран окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и периодической кислотой-Шиффа (PAS) для визуализации ресничек и муцинов.Ресничные клетки и бокаловидные клетки подсчитывали с использованием объектива 20×, и результаты выражали как среднее количество клеток на 500 мкм длины мембраны.

Анализ биения ресничек

Культуры на 28-й день ALI промывали средой ALI и регистрировали биение ресничек в течение 10 с с помощью камеры захвата движения Hamamatsu ORCA-Flash с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Авторегрессионный спектральный анализ выполнялся на быстрых преобразованиях Фурье интенсивности изображения, которые давали спектр частот биений в каждом захвате движения [38, 39].Процент общего частотного спектра, попадающего под доминирующий пик (самой высокой интенсивности), рассчитывали для каждой из 5 областей на мембрану. Эти области были выбраны на основе отсутствия свободно плавающих обломков во время 10-секундной записи и в остальном были выбраны «вслепую», поскольку различия биений не могли быть определены визуально. Доминирующие амплитуды биения ресничек в интересующих областях также рассчитывали с помощью анализа параметрической реконструкции. Анализы проводились с использованием программного обеспечения AutoSignal, v1.7 (Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния).

Количественная ПЦР

РНК собирали из вставок ALI на 1-й и 28-й день и экстрагировали с использованием набора RNeasy Plus Mini и колонок в соответствии с протоколом производителя (Qiagen, Venlo, Нидерланды). Тотальную РНК превращали в кДНК с использованием набора обратной транскриптазы iScript (BioRad, Hercules, CA). КПЦР проводили с использованием SYBR Green в секвенаторе ABI (Waltham, MA) StepOne и праймерах для FOXJ1, MUC5AC, MUC5B, RARRES1, RDh22 и CRNN. 18S использовали в качестве эндогенного контроля, и кратность изменения транскрипции гена рассчитывали с помощью анализа ddCt.Последовательности праймеров (QStar, Origene Technologies, Rockville, MD) можно найти в дополнительном файле 5.

Ультраструктурная визуализация аксонем ресничек

Культуры клеток фиксировали в 3% глутаральдегиде на 28-й день ALI. Мембраны промывали PBS перед публикацией. -фиксировать в 1% четырехокиси осмия. Затем мембраны окрашивали уранилацетатом и обезвоживали в ранее описанной серии этанола с последующим погружением в ацетон. Образцы заливали эпоксидной смолой Polybed 812. Мембранные блоки разрезали на тонкие срезы размером 80–90 нм, помещали на медные сетки 200 меш, а затем снова окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца.Цифровые изображения были получены с помощью камеры Orius SC1000/SC600 (Gatan, Pleasanton, CA), прикрепленной к просвечивающему электронному микроскопу Tecnai T120 (FEI/Thermo Fisher, Wlatham, MA). Изображения с четкими ненаклонными поперечными сечениями ресничек использовались для подсчета аномалий в расположении микротрубочек аксонемы 9 + 2 и/или аномалий динеиновых ветвей. Всего для этой цели подсчитывали 224 обработанных носителем контрольных и 234 обработанных MWCNT поперечных срезов ресничек.

Конфокальная микроскопия раннего цилиогенеза

Структуру актина и γ-тубулина исследовали во вкладышах, зафиксированных на 3, 5 и 14 дни ALI.Мембраны фиксировали 4% PFA марки EM в течение 15 минут, а избыток альдегидов гасили 0,1 М глицином в PBS в течение 5 минут. Клетки пермеабилизировали 0,1% TritonX-100 в PBS в течение 15 минут и промывали 3 раза PBS. Мембраны блокировали 1 % BSA и 5 % козьей сыворотки в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре. Кроличье анти-γ-тубулиновое mAb (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, разбавленное 1:800 в блокирующем растворе) наносили на ночь при 4°C. После трех 5 минутных промывок PBS мембраны инкубировали с Alexa594-конъюгированным козьим антикроличьим и Alexa488-конъюгированным фаллоидином (Thermo Fisher, Waltham, MA, разбавленный 1:1000 и 1:200 в 25% блокирующем растворе, соответственно) в течение 1- ч при комнатной температуре.Мембраны снова промывали PBS (3 раза по 5 минут каждый) перед тем, как их вырезали из пластиковых литников и помещали на предметные стекла с Prolong Gold. Изображения Z-стека апикальных 10 мкм каждой мембраны были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss (Оберкохен, Германия) 880 с использованием Airyscan для визуализации в программном обеспечении Zen (иммерсионный объектив 63×). Такие параметры, как усиление, точечное отверстие, интенсивность лазера, z-плоскости на стопку и постобработка изображения, сохранялись постоянными между процедурами.

CEP164 и γ-тубулин окрашивали в сходных условиях с использованием мышиного анти-CEP164 (Sigma Aldrich, St.Louis, Миссури, разбавленный 1:800) и блокирующий раствор, содержащий 10 % козьей сыворотки и 5 % BSA. Для визуализации CEP164 и γ-тубулина использовали козьи антимышиные антитела, конъюгированные с Alexa488, и ранее упомянутые вторичные антитела против Alexa594 антикроличьи (Thermo Fisher, Waltham, MA, разбавленные 1:1000 в блокирующем растворе). Для идентификации клеток использовали краситель Hoechst (разведение 1:1000) (не показано на изображениях). Для контроля неспецифического окрашивания использовались первичные контрольные антитела изотипа (найдены в дополнительном файле 4).Конфокальные Z-стеки были взяты из апикальных 6 мкм каждой мембраны, также с использованием визуализации Airyscan с 4-кратным программным увеличением (тот же микроскоп/объектив).

Измерение TEER дифференцирующихся культур ALI

Культуры ALI от одного донора использовали для измерений TEER во время дифференциации после обработки наноматериалом. Каждые 2 дня после перехода на ALI апикальную камеру каждой лунки ненадолго заполняли 300 мкл среды ALI, взятой из базальной камеры (во избежание введения каких-либо новых питательных веществ, которые могли бы изменить клеточную биохимию во время измерения), чтобы можно было измерить TEER.Одно измерение TEER регистрировали в каждой лунке с помощью вольтомметра ERS-2 (EMD Millipore, Дармштадт, Германия) с датчиком STX01 в соответствии с инструкциями производителя.